Technique d’évaluation de la localisation in vivo d’anticorps spécifiques à une tumeur

Prenez une suspension de cellules cancéreuses de l’ovaire humain. Ajoutez un milieu de matrice de membrane basale et conservez sur de la glace pour éviter la formation de gel.

Chargez le mélange dans une seringue et injectez-le par voie sous-cutanée dans une souris nue athymique. Retirez l’aiguille une fois que la matrice subit une gélification, empêchant ainsi l’expulsion du mélange.

L’absence de réponse immunitaire chez la souris immunodéficiente préserve la viabilité des cellules injectées. Les protéines de la matrice extracellulaire et les facteurs de croissance du gel fournissent des signaux favorisant la croissance, facilitant la formation de tumeurs.

Les cellules tumorales surexpriment le récepteur de folate alpha-1 lié à la surface, ou FOLR1.

Prenez des anticorps spécifiques de FOLR1. Ajoutez un colorant fluorescent et incubez, permettant la conjugaison du colorant avec les anticorps.

Injectez par voie intraveineuse les anticorps marqués dans la souris porteuse d’une tumeur anesthésiée.

Les anticorps atteignent la tumeur par circulation et se lient à FOLR1 sur les cellules tumorales, marquant par fluorescence la surface cellulaire.

Réaliser l’imagerie de fluorescence in vivo. Lors de l’excitation, le colorant émet une fluorescence, facilitant l’évaluation de la localisation des anticorps dans la tumeur.

Dialysez 0,5 millilitre d’anticorps à l’aide d’une cassette de dialyse dans 1 litre de tampon de conjugaison. Après quatre heures, transférez la cassette de dialyse dans un nouveau tampon et dialysez pendant la nuit. Pour mettre en place une réaction de conjugaison, ajoutez 0,03 microgramme d’IRDye 800CW pour 1 milligramme d’anticorps dans un volume total de 500 microlitres.

Incuber le mélange pendant deux heures à 20 degrés Celsius. Ensuite, purifier les conjugués marqués par dialyse extensive contre le PBS. Estimez le degré de marquage en mesurant l’absorbance du colorant à 780 nanomètres et l’absorbance de la protéine à 280 nanomètres.

Pour développer des xénogreffes de souris, soulevez doucement la peau de l’animal et séparez-la de la couche musculaire sous-jacente. Injectez lentement 100 microlitres de suspension cellulaire sous la peau avec une aiguille de calibre 26. Attendez quelques secondes avant de retirer l’aiguille afin que le milieu matriciel puisse former une structure semi-solide semblable à un gel avec des cellules sous la peau, ce qui empêchera le mélange de sortir du site d’injection.

Pour effectuer une imagerie in vivo, injectez l’anticorps marqué au colorant par la veine de la queue. Après avoir anesthésié la souris, vérifiez l’absence de réponse aux réflexes de pédale et dilatez la veine en appliquant de l’eau tiède. Utilisez une seringue à insuline de 1 CC avec une aiguille de calibre 26 pour injecter 25 microgrammes de l’anticorps marqué dans un volume de 100 microlitres. En tant que contrôle négatif, étiqueter et injecter l’anticorps isotype IgG non spécifique qui ne cible pas les cellules cancéreuses.

Réaliser l’imagerie in vivo 8, 24 et 48 heures après les injections d’anticorps. Dans le logiciel de création d’images, cliquez sur Initialiser. Vérifiez que la température de la scène est de 37 degrés Celsius. Dans le panneau de configuration, configurez l’imagerie par fluorescence via l’assistant d’imagerie et réglez l’excitation sur 773 nanomètres et l’émission sur 792 nanomètres.

Transférez la souris anesthésiée dans la chambre d’imagerie et positionnez-la sur le champ d’imagerie à l’aide du cône nasal. Lorsque vous êtes prêt, cliquez sur Acquérir dans le panneau de configuration pour l’acquisition d’images, puis cliquez sur Exposition automatique. L’image générée est la superposition de la fluorescence sur l’image photographique, l’intensité de la fluorescence optique étant affichée en unités de comptage ou de photons.