Coloration des cellules bactériennes et préparation pour les études immunologiques

Commencez par un tube contenant une culture bactérienne en phase exponentielle, garantissant des bactéries uniformes et en croissance active pour des résultats cohérents.

Centrifuger pour collecter les cellules, aspirer le surnageant contenant des débris et remettre les cellules en suspension.

Introduisez un colorant fluorescent rouge perméable aux cellules. Les molécules de colorant pénètrent dans la membrane cellulaire bactérienne et atteignent le nucléoïde, se liant à l’ADN et conférant une fluorescence rouge aux bactéries.

Centrifugeuse pour granuler les bactéries colorées et aspirer le surnageant contenant un colorant non lié.

Remettez les bactéries en suspension dans un milieu de croissance pour maintenir la viabilité cellulaire.

À l’aide d’un photomètre, mesurez l’absorbance de la suspension bactérienne diluée à 600 nanomètres.

Comparez la valeur d’absorbance avec une courbe standard pour déterminer la concentration bactérienne.

Transférez le volume souhaité de la suspension bactérienne colorée dans un tube frais contenant un milieu de croissance. Il s’agit d’atteindre la concentration bactérienne souhaitée pour l’infection de la cellule hôte représentant la multiplicité de l’infection, ou MOI.

Les bactéries colorées avec le MOI souhaité sont prêtes pour les études immunologiques.

Tout d’abord, récoltez les cultures bactériennes en phase exponentielle par centrifugation à 13 000 fois g pendant deux minutes à température ambiante. Après avoir lavé la pastille cellulaire avec un millilitre de PBS, remettez en suspension la pastille bactérienne dans un millilitre de PBS.

Déterminer les concentrations de suspension bactérienne en mesurant la densité optique à 600 nanomètres. Ensuite, pour colorer la suspension bactérienne, ajoutez deux microlitres de colorant vert ou rouge concentré 500 fois dans un millilitre de suspension bactérienne pour diluer le colorant une fois. Incuber les cellules à température ambiante pendant 30 minutes avec une rotation douce dans l’obscurité.

Après 30 minutes, centrifugez les bactéries colorées à 13 000 fois g pendant deux minutes et remettez la pastille en suspension dans un millilitre de PBS. Recueillir les cellules bactériennes colorées par centrifugation à 13 000 fois g pendant deux minutes. Remettez la pastille en suspension dans un millilitre de milieu F-12K frais et mesurez la densité optique de chaque culture à 600 nanomètres. Par la suite, diluez les cultures aux concentrations souhaitées, en fonction de la multiplicité de l’infection et de la concentration de la cellule hôte.