Méthode de localisation par immunofluorescence in vivo pour étudier la biodistribution des anticorps

Prenons un modèle murin de cancer du sein. Les tumeurs de la glande mammaire comprennent des cellules cancéreuses, des fibroblastes associés au cancer, des adipocytes, des cellules immunitaires et un système vasculaire tumoral.

Injecter par voie intraveineuse des anticorps spécifiques de la tumeur conjugués aux fluorophores.

Lorsqu’ils atteignent le système vasculaire tumoral, les anticorps se lient aux protéines transmembranaires spécifiques de la tumeur sur l’endothélium du vaisseau et les cellules cancéreuses voisines.

Isolez chirurgicalement la glande mammaire et immergez-la dans un milieu de congélation.

Obtenez des cryo-sections sur une lame et rincez avec un tampon pour éliminer le fluide de congélation.

Fixez les sections pour préserver l’architecture tissulaire. Appliquez un détergent pour améliorer l’immunocoloration et une solution bloquante pour empêcher la liaison d’anticorps non spécifiques.

Introduire un anticorps primaire spécifique des molécules d’adhésion sur l’endothélium du vaisseau sanguin, et un anticorps secondaire conjugué au fluorophore qui se lie à l’anticorps primaire, marquant le système vasculaire.

Ajoutez un support de montage sur la diapositive et placez une lamelle.

À l’aide d’un microscope confocal, évaluez la biodistribution des anticorps spécifiques de la tumeur dans et autour du système vasculaire tumoral marqué par fluorescence.

Après l’anesthésie décrite dans le protocole textuel, préparez-vous à l’inoculation des solutions d’anticorps dans la veine caudale. Désinfectez la queue de l’animal en l’essuyant trois fois avec une lingette imbibée d’alcool. Dilater les veines de la queue en les réchauffant avec un coussin chauffant pendant environ 30 secondes ; Évitez de chauffer l’animal entier. À l’aide d’un cathéter à ailette de queue de calibre 27, insérez l’aiguille papillon dans l’une des deux veines latérales de la queue.

Visualisez le reflux sanguin dans le cathéter pour vous assurer que l’aiguille est correctement placée afin que les solutions pénètrent complètement dans l’animal au lieu d’être capturées dans la queue.

Utilisez un morceau de ruban chirurgical pour fixer soigneusement la queue avec l’aiguille insérée à la scène. Rincez le cathéter avec 25 microlitres de solution saline stérile tamponnée au phosphate. Ensuite, injectez la solution d’anticorps dans le cathéter à l’aide de seringues à insuline. Rincez à nouveau le cathéter avec 25 microlitres de PBS stérile. Retirez l’aiguille de la queue et appliquez une pression pour arrêter tout saignement.

Effectuez l’euthanasie sans cruauté de la souris, comme décrit dans le protocole de texte, et posez la souris en position couchée. Utilisez des ciseaux chirurgicaux et des pinces pour exciser les tissus tumoraux. Utilisez une pince pour saisir uniquement la couche externe de peau entre l’ensemble des glandes mammaires les plus proches de la queue et pour faire une petite incision avec une paire de ciseaux chirurgicaux. Introduisez les ciseaux fermés dans la coupe et ouvrez lentement la pointe pour séparer soigneusement la peau de la membrane sous-jacente de la paroi abdominale, en la gardant intacte.

Faites une incision verticale le long de l’abdomen, en continuant à séparer la peau de la membrane interne. Entre la troisième et la quatrième glande mammaire, faites une coupe horizontale à travers l’abdomen, pour permettre la rétraction de la peau et la visualisation des glandes mammaires. En saisissant chaque tumeur ou glande normale à l’aide d’une pince, coupez soigneusement la peau attachée à l’aide de ciseaux chirurgicaux.

Placez les mouchoirs excisés dans des moules de base jetables en papier qui sont pré-étiquetés et remplis d’un milieu d’enrobage à température de coupe optimale. Congelez rapidement les moules en les plaçant sur de la glace sèche. Afin d’étudier l’administration hors cible, excisez d’autres tissus ou organes d’intérêt. À l’aide d’un cryostat, sectionnez des blocs de tissus congelés d’une épaisseur de 10 microns et placez les sections adjacentes sur des lames de verre d’adhérence pré-étiquetées.

Rincez les lames de tissu congelées avec du PBS à température ambiante pendant 5 minutes pour retirer le milieu d’enrobage. Délimitez les coupes de tissus à l’aide d’un stylo barrière hydrophobe pour réduire le volume de solutions nécessaires lors de la coloration. Fixez les sections de tissu avec une solution de paraformaldéhyde à 4 % pendant 5 minutes. Après avoir rincé les lames dans du PBS pendant 5 minutes, perméabilisez des sections de tissus avec 0,5 % de Triton X-100 dans du PBS pendant 15 minutes. Rincez à nouveau les lames dans du PBS pendant 5 minutes.

Bloquez les tissus avec du PBS contenant 3 % en poids par volume d’albumine sérique bovine et 5 % en volume de sérum de chèvre pendant 1 heure à température ambiante. Après avoir rincé les lames dans du PBS pendant 5 minutes, incubez les sections avec des anticorps primaires enregistrés, tels qu’un marqueur nucléaire, vasculaire ou cytoplasmique commun. Ici, l’anti-souris CD31 pour rat est utilisé à une dilution de 1 à 100 dans la solution bloquante. Les lames avec l’anticorps primaire sont laissées toute la nuit à 4 degrés Celsius, à l’abri de la déshydratation sur un plateau de lames.

Après l’incubation, rincez les lames dans du PBS pendant 5 minutes trois fois. Changez le PBS à chaque fois. Incuber les lames avec des anticorps secondaires pour marquer les anticorps primaires. Pour cette application, visualisez l’anticorps anti-B7-H3 à l’aide de l’anticorps anti-lapin conjugué AlexaFluor-546, et visualisez CD31 avec l’anticorps secondaire anti-rat AlexaFluor-488 dans une solution bloquante. Protégez les lames de la lumière et de la déshydratation sur un plateau de lames pendant 1 heure à température ambiante.

Après avoir rincé les lames dans du PBS, comme précédemment, appliquez une goutte du support de montage au centre de la tranche de tissu. Placez soigneusement une lamelle pour éviter de piéger les bulles d’air. Scellez les bords de la lamelle avec du vernis à ongles transparent et laissez sécher. Procéder à l’imagerie par microscopie confocale et à l’analyse quantitative des images, comme décrit dans le protocole texte.