Utilisation de l’hybridation in situ par fluorescence immuno-ARN pour visualiser le SRAS-CoV-2

Prenez des cellules Vero infectées par un coronavirus fixes et perméabilisées, une lignée cellulaire de mammifère déficiente en interféron.

À l’intérieur de l’hôte, l’ARN viral est présent sous forme de sous-génomique ou d’ARNsg, des molécules d’ARN de longueur intermédiaire codant pour des protéines virales spécifiques synthétisées par transcription.

Ajouter des sondes d’hybridation, de réaction en chaîne ou d’initiateur HCR.

La sonde HCR se lie à sa séquence complémentaire sur l’ARN cible.

Introduire des sondes en épingle à cheveux oligonucléotidiques marquées par fluorescence, H-1 et H-2.

La sonde initiatrice se lie à sa queue H1 complémentaire, linéarisant la structure de l’épingle à cheveux.

La séquence H1 exposée se lie à sa queue H2 complémentaire.

La séquence H2 continue de se lier à une queue H1, amplifiant les sondes marquées par fluorescence autour de la zone cible et générant un signal robuste.

Ajoutez les anticorps appropriés pour visualiser le cytosquelette de la cellule hôte.

Colorer les noyaux à l’aide de DAPI.

Au microscope à fluorescence, les cellules infectées par le virus présentent une fluorescence rouge dans le cytoplasme, indiquant la présence de l’ARN cible.

Après avoir fixé et perméabilisé les cellules, comme décrit dans le manuscrit du texte, retirez la solution 1x PBS des puits et ajoutez au moins 300 microlitres de tampon d’amplification dans chaque puits. Incuber les échantillons pendant 30 minutes à température ambiante. Préparez chaque épingle à cheveux HCR en refroidissant le volume souhaité dans des tubes séparés.

Pour préparer 300 microlitres de solution d’amplification, utilisez 18 picamoles de chaque épingle à cheveux. Transférez la solution en épingle à cheveux dans des tubes et incubez-les à 95 degrés Celsius pendant 90 secondes. Ensuite, laissez refroidir à température ambiante pendant 30 minutes à l’obscurité. Préparez un mélange d’épingles à cheveux en ajoutant les épingles à cheveux H1 et H2 refroidies par pression au tampon d’amplification. Placez des gouttes de 30 à 50 microlitres de mélange d’épingle à cheveux sur du parafilm et incubez les échantillons pendant la nuit dans l’obscurité à température ambiante.

Pour monter les diapositives, placez deux gouttes de 10 microlitres de support de montage sur une diapositive, en vous assurant que les gouttes sont suffisamment séparées pour permettre de placer deux lamelles sur une seule lame. Retirez l’excès de liquide en tapotant les lamelles sur une serviette propre. Ensuite, placez-les dans un support de montage anti-décoloration avec les cellules vers le bas. Placez les échantillons montés sur une surface plane et sèche dans l’obscurité et laissez-les durcir.