Évaluation de l’efficacité d’un composé d’essai antiviral au moyen d’un essai d’inactivation virale

Prélever des tubes contenant un virus de l’hépatite C recombinant, ou une suspension du VHC contenant de l’ARN codant pour un rapporteur de luciférase sécrété.

Ajoutez un composé de test antiviral et un solvant dans les tubes de test et de contrôle négatif.

Les composés testés se lient aux glycoprotéines du VHC, inactivant le virus.

Après l’incubation, diluez les mélanges pour éviter les interactions composé-cellule dans les étapes suivantes.

Ajoutez ces mélanges dilués sur des monocouches d’hépatome favorisant la réplication du VHC. Couver.

Le VHC inactivé par un composé ne peut pas se fixer à des récepteurs de surface cellulaires spécifiques, tandis que les glycoprotéines actives du VHC se lient à ces récepteurs, facilitant ainsi l’attachement cellulaire.

Éliminer les VHC non adsorbés. Laver avec un tampon et ajouter du support. Incuber pendant une durée prolongée.

Le VHC lié est internalisé, libérant de l’ARN viral et conduisant à la synthèse des protéines virales et de la luciférase, sécrétées par la cellule.

Récupérez les surnageants de culture contenant de la luciférase. Centrifuger et ajouter un substrat de luciférase aux surnageants.

La luciférase oxyde le substrat en émettant de la lumière.

Une luminescence plus élevée dans le puits témoin que dans le test indique une inactivation virale par le composé.

Pour commencer l’essai d’inactivation virale, il faut d’abord appliquer une plaque de 1 fois 10 à la quatrième cellule par puits dans une plaque de 96 puits. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant la nuit pour la fixation. En cas d’infection, préparez des particules du virus de l’hépatite C ou du VHC marquées Gaussia luciferase, comme indiqué dans le protocole de texte.

Dans un tube stérile, mélanger 100 microlitres de CHLA ou PUG de 100 micromolaires avec 100 microlitres de 10 à la quatrième unité focalisante ou FFU du VHC. Pour un contrôle positif, mélanger le VHC avec de l’héparine à une concentration finale de 1 000 microgrammes par millilitre. Incuber à 37 degrés Celsius pendant trois heures.

Après trois heures, diluez le mélange de composés viraux 50 fois avec 9,8 millilitres de milieu de base à température ambiante. Ensuite, préparez un nouveau mélange de composés viraux et diluez immédiatement ce mélange dans un milieu basal pour l’échantillon d’incubation de l’heure zéro. Après avoir retiré le milieu d’incubation des cellules, ajoutez 100 microlitres de la solution médicamenteuse virale diluée par puits en trois exemplaires.

La solution contient maintenant 10 FFU par puits. Incuber à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant trois heures pour permettre l’infection virale des cellules. Après l’incubation, retirez la suspension virale des puits et lavez doucement les cellules avec 200 microlitres de PBS à deux reprises.

Incuber les cellules dans 100 microlitres de milieu basal pendant 72 heures pour la réplication virale et la libération de la luciférase rapporteure dans le surnageant. Ensuite, collectez les surnageants des cultures dans des microtubes et centrifugez à 17 000 fois g pendant 5 minutes à 4 degrés Celsius pour éliminer les débris cellulaires. Mélangez 20 microlitres de chaque surnageant avec 50 microlitres de réactif de dosage de la luciférase gaussia, et mesurez la luminescence de l’activité du rapporteur de la luciférase dans un luminomètre.