Un test pour déterminer l’initiation d’un biofilm polymicrobien sur des cellules infectées par le virus

Prenez une plaque multi-puits contenant des monocouches de cellules de mammifères.

Puits d’essai de semences avec le virus de l’herpès simplex. Les puits de contrôle sont dépourvus du virus.

Le virus se fixe à l’héparane sulfate de surface cellulaire et est internalisé par endocytose.

L’infection virale déclenche la sécrétion d’héparanase, qui clive le sulfate d’héparane et démasque des récepteurs fongiques spécifiques.

Co-incubez les cellules avec des tubes germinatifs de Staphylococcus aureus et de Candida albicans.

Dans les cellules infectées par le virus, la déplétion en sulfate d’héparane inhibe l’interaction bactérienne tout en favorisant les interactions entre les récepteurs fongiques, empêchant ainsi la co-localisation bactérienne-fongique.

Dans les cellules témoins, les bactéries interagissent avec le sulfate d’héparane, tandis que les champignons se lient aux récepteurs disponibles.

Cette co-localisation microbienne initie l’adhérence – la première étape de la formation du biofilm.

Après l’incubation, retirez les microbes non liés. Recouvrir d’un tampon de lyse, libérant des bactéries et des champignons dans le support.

Étalez le lysat cellulaire sur des plaques contenant des milieux de croissance. Incuber pour la formation de colonies.

Une diminution des colonies bactériennes avec une augmentation correspondante des colonies fongiques indique une inhibition induite par le virus de la co-localisation bactérienne-fongique et de l’initiation du biofilm.

Pour réaliser un test de biofilm polymicrobien, ensemencez des plaques de 96 puits avec 200 microlitres de 2 fois 10 à la 5e cellules HeLa par millilitre. Secouez les plaques à 37 degrés Celsius pendant 30 à 45 minutes, avant de les incuber dans 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant 18 heures. Utilisez 1x optimum pour laver les monocouches. Ensuite, semez avec une seule souche de HSV. Testez une seule souche à la fois.

Incuber les plaques à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone pendant trois heures. À l’aide de 100 microlitres de PBS à 37 degrés Celsius avec du magnésium et du calcium, lavez les monocouches infectées. Ensuite, utilisez 37 degrés Celsius HBSS pour remplacer le PBS. Laissez 25 microlitres de HBSS dans chaque puits.

Ensuite, ajoutez des suspensions de travail GT et/ou S. aureus, et incubez les plaques à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone pendant 30 minutes. Après l’incubation, aspirez une colonne de la plaque à la fois. Remplissez immédiatement les puits avec 300 microlitres de PBS avec du magnésium et du calcium.

Après avoir répété cette étape de lavage deux fois, ajoutez 200 microlitres à une dilution de 1 à 50 de tampon de lyse RIPA stérilisé par filtre dans chaque puits.

Lorsque vous travaillez avec d’autres souches de bactéries ou de champignons, assurez-vous que la concentration de RIPA utilisée est suffisante pour la lyse cellulaire, mais toujours permissive pour les tests de viabilité microbienne.

Triturez rapidement le lysat de cellules HeLa et pipetez 50 microlitres sur des sels de mannitol et/ou un milieu fongicide. Ensuite, à l’aide d’une tige de verre pliée à un angle de 90 degrés, étalez le lysat sur la surface de la plaque.

Après avoir incubé les plaques pendant 18 heures, comptez manuellement le nombre de colonies par plaque. Les témoins sont constitués de l’adhésion de S. aureus et/ou de C. albicans aux cellules HeLa non infectées par le HSV.