Un test d’utilisation de l’ATP pour déterminer la survie bactérienne sous traitement antibiotique

Commencez par ensemencer une culture bactérienne dans une plaque d’essai. Ensuite, incubez l’assiette.

Les cellules bactériennes ont des adhérences de surface et des pili qui leur permettent d’adhérer les unes aux autres, formant de petits agrégats.

Ajoutez des concentrations variables d’antibiotiques dans les puits, en laissant un non traité pour un contrôle.

Les molécules antibiotiques interagissent avec les bactéries sensibles, affectant leur capacité à croître et à se reproduire, entraînant leur mort.

Les bactéries résistantes aux antibiotiques restent métaboliquement actives, produisant des molécules d’ATP.

Utilisez un sonicateur pour perturber les cellules bactériennes, libérant leur contenu intracellulaire, y compris l’ATP.

Ajoutez un réactif de lueur d’utilisation de l’ATP contenant de la luciférine, de l’enzyme luciférase et d’autres cofacteurs.

La luciférase utilise l’ATP et l’oxygène pour convertir la luciférine en une oxyluciférine excitée.

L’oxyluciférine passe ensuite à son état fondamental, émettant une lumière luminescente.

Mesurez l’absorbance à l’aide d’un lecteur de plaques.

La diminution de l’absorbance à des concentrations d’antibiotiques plus élevées suggère une production d’ATP plus faible, indiquant un taux de survie bactérienne réduit.

Mesurez la densité optique à 650 nanomètres ou OD₆₅₀ pour déterminer la concentration des bactéries en suspension, et ajustez la concentration de GC à environ 1 x 10⁸ unités formant colonies par millilitre. Ensuite, ajoutez 99 microlitres de suspension GC dans des puits individuels d’une plaque de 96 puits et laissez les bactéries s’agréger à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 6 heures.

À la fin de l’incubation, ajoutez 1 microlitre de ceftriaxone dilué en série dans chaque puits, en laissant certains puits non traités pour servir de témoins, et retournez la plaque dans l’incubateur pendant encore 24 heures. Le lendemain, sonifiez la suspension dans chaque puits trois fois à 144 watts et 20 kilohertz pendant 5 secondes par sonication, et ajoutez 100 microlitres de réactif d’utilisation de l’ATP disponible dans le commerce à chaque puits.

Transférez soigneusement 150 microlitres de mélange de chaque puits dans des puits individuels d’une nouvelle microplaque noire de 96 puits et mesurez l’absorbance de chaque puits à 560 nanomètres sur un lecteur de plaques. Ensuite, calculez le taux de survie par le rapport entre la lecture obtenue après un traitement antibiotique en série et la lecture des puits non traités.