Visualisation de la formation et de la fermeture des phagosomes par microscopie TIRF

Prenez une parabole à fond en verre recouvert de polymère contenant des globules rouges opsonisés aux IgG ou des globules rouges collés à sa surface.

Placez la parabole sur une platine de microscope à fluorescence à réflexion interne totale, en la maintenant à température physiologique.

Ajoutez des macrophages contenant des peptides cytoplasmiques marqués par fluorescence qui se lient à l’actine polymérisée, facilitant ainsi la visualisation du cytosquelette.

Pendant l’imagerie, dirigez un faisceau laser à un angle supérieur à l’angle critique, provoquant une réflexion interne et une génération d’ondes évanescentes au point de contact.

Les ondes évanescentes éclairent sélectivement les fluorophores à l’interface verre-échantillon, permettant une visualisation en temps réel de la phagocytose.

Les récepteurs Fc des macrophages se lient aux globules rouges opsonisés par les IgG, provoquant l’agrégation des récepteurs autour de la zone de contact.

Le regroupement déclenche les voies de signalisation intracellulaires et l’activation de la GTPase, entraînant la polymérisation de l’actine et le recrutement de dynamines, formant des pseudopodes.

Les pseudopodes s’étendent autour du globule rouge, formant une coupe phagocytaire.

Finalement, les pointes des pseudopodes fusionnent. La dynamine accumulée médie la séparation des phagosomes de la membrane cellulaire, internalisant les globules rouges opsonisés.

Pour la fixation non covalente des SRBC, versez 2 millilitres de cellules opsonisées en IgG dans chacune des boîtes recouvertes de polylysine et centrifugez les échantillons dans une centrifugeuse à rotor oscillant. Jetez les surnageants et lavez les particules une fois avec 2 millilitres de PBS plus 10 % de BSA.

Ensuite, incubez les particules avec 2 millilitres de PBS frais plus 10 % de BSA pendant 30 minutes à température ambiante, suivis de trois lavages avec 2 millilitres de PBS. Après le dernier lavage, remplacez le PBS par 2 millilitres de milieu de microscopie sans sérum à 37 degrés Celsius.

Placez une parabole codée SRBC sur la platine du microscope. Ensuite, grattez les cellules d’intérêt transfectées du fond de la boîte de culture et pipetez les cellules à quelques reprises pour obtenir une suspension unicellulaire. Ajoutez les cellules transfectées dans la boîte recouverte de SRBC.

Démarrez le logiciel d’acquisition en direct. Trouvez une cellule qui exprime les protéines marquées par fluorescence et ajustez la position de la boîte de sorte qu’une cellule d’intérêt se trouve au milieu du champ. Acquérez 500 images sous différents angles de 0 à 5 degrés par incréments de 0,01 degré à une longueur d’onde d’excitation.

Pour déterminer l’angle critique pour que la lumière incidente soit totalement réfléchie à l’interface verre-milieu et génère une onde évanescente, ouvrez la séquence d’images dans le logiciel d’imagerie approprié. Sélectionnez une région d’intérêt dans la cellule avec une fluorescence uniforme.

Ensuite, sous l’onglet Image, sélectionnez Piles et tracez le profil de l’axe Z. Pour tracer le profil de l’axe Z, l’intensité moyenne de la fluorescence mesurée dans la région d’intérêt avec la fonction des angles sur l’axe des X. Toute valeur d’angle sur l’axe des x supérieure à l’angle critique peut alors être utilisée pendant la séance de microscopie pour obtenir un signal TIRF.