Visualisation de la formation et de la fermeture des phagosomes par microscopie TIRF
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 vues • 4:13 min • July 8th, 2025
Prenez une parabole à fond en verre recouvert de polymère contenant des globules rouges opsonisés aux IgG ou des globules rouges collés à sa surface.
Placez la parabole sur une platine de microscope à fluorescence à réflexion interne totale, en la maintenant à température physiologique.
Ajoutez des macrophages contenant des peptides cytoplasmiques marqués par fluorescence qui se lient à l’actine polymérisée, facilitant ainsi la visualisation du cytosquelette.
Pendant l’imagerie, dirigez un faisceau laser à un angle supérieur à l’angle critique, provoquant une réflexion interne et une génération d’ondes évanescentes au point de contact.
Les ondes évanescentes éclairent sélectivement les fluorophores à l’interface verre-échantillon, permettant une visualisation en temps réel de la phagocytose.
Les récepteurs Fc des macrophages se lient aux globules rouges opsonisés par les IgG, provoquant l’agrégation des récepteurs autour de la zone de contact.
Le regroupement déclenche les voies de signalisation intracellulaires et l’activation de la GTPase, entraînant la polymérisation de l’actine et le recrutement de dynamines, formant des pseudopodes.
Les pseudopodes s’étendent autour du globule rouge, formant une coupe phagocytaire.
Finalement, les pointes des pseudopodes fusionnent. La dynamine accumulée médie la séparation des phagosomes de la membrane cellulaire, internalisant les globules rouges opsonisés.
Pour la fixation non covalente des SRBC, versez 2 millilitres de cellules opsonisées en IgG dans chacune des boîtes recouvertes de polylysine et centrifugez les échantillons dans une centrifugeuse à rotor oscillant. Jetez les surnageants et lavez les particules une fois avec 2 millilitres de PBS plus 10 % de BSA.
Ensuite, incubez les particules avec 2 millilitres de PBS frais plus 10 % de BSA pendant 30 minutes à température ambiante, suivis de trois lavages avec 2 millilitres de PBS. Après le dernier lavage, remplacez le PBS par 2 millilitres de milieu de microscopie sans sérum à 37 degrés Celsius.
Placez une parabole codée SRBC sur la platine du microscope. Ensuite, grattez les cellules d’intérêt transfectées du fond de la boîte de culture et pipetez les cellules à quelques reprises pour obtenir une suspension unicellulaire. Ajoutez les cellules transfectées dans la boîte recouverte de SRBC.
Démarrez le logiciel d’acquisition en direct. Trouvez une cellule qui exprime les protéines marquées par fluorescence et ajustez la position de la boîte de sorte qu’une cellule d’intérêt se trouve au milieu du champ. Acquérez 500 images sous différents angles de 0 à 5 degrés par incréments de 0,01 degré à une longueur d’onde d’excitation.
Pour déterminer l’angle critique pour que la lumière incidente soit totalement réfléchie à l’interface verre-milieu et génère une onde évanescente, ouvrez la séquence d’images dans le logiciel d’imagerie approprié. Sélectionnez une région d’intérêt dans la cellule avec une fluorescence uniforme.
Ensuite, sous l’onglet Image, sélectionnez Piles et tracez le profil de l’axe Z. Pour tracer le profil de l’axe Z, l’intensité moyenne de la fluorescence mesurée dans la région d’intérêt avec la fonction des angles sur l’axe des X. Toute valeur d’angle sur l’axe des x supérieure à l’angle critique peut alors être utilisée pendant la séance de microscopie pour obtenir un signal TIRF.
Aperçu
Cet article décrit une méthode de visualisation en temps réel de la phagocytose à l'aide de la microscopie de fluorescence par réflexion totale interne. La technique implique l'utilisation de globules rouges opsonisés par l'IgG et de macrophages marqués par des peptides cytoplasmiques fluorescents.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie cellulaire
- Immunologie
- Techniques de microscopie
Contexte
- La phagocytose est un processus essentiel dans la réponse immunitaire.
- Comprendre la dynamique de la phagocytose peut fournir des informations sur le fonctionnement du système immunitaire.
- La microscopie de fluorescence par réflexion totale interne (TIRF) permet une imagerie à haute résolution au niveau de la membrane cellulaire.
- Le marquage fluorescent des composants cytoplasmiques facilite la visualisation des processus cellulaires.
Objectif de l'étude
- Visualiser en temps réel le processus de phagocytose.
- Étudier le rôle de la polymérisation de l'actine dans le comportement des macrophages.
- Utiliser la microscopie TIRF pour améliorer l'imagerie des interactions cellulaires.
Méthodes utilisées
- Préparation de globules rouges opsonisés par des IgG et adhérés à une lame de verre.
- Utilisation de macrophages contenant des peptides marqués de façon fluorescente.
- Application de la microscopie par fluorescence induite en ondes évanescentes (TIRF) pour visualiser la phagocytose.
- Acquisition d'images selon différents angles afin de déterminer les angles critiques pour la TIRF.
Résultats principaux
- L'imagerie en temps réel des interactions entre les macrophages et les globules rouges a été réalisée avec succès.
- La polymérisation de l'actine a été observée lors de la formation des cupules phagocytaires.
- Les angles critiques pour la fluorescence induite par réflexion totale ont été déterminés afin d'obtenir des conditions d'imagerie optimales.
- Les signaux fluorescents ont permis d'obtenir des informations sur la dynamique de la phagocytose.
Conclusions
- La présente étude décrit une méthode fiable pour visualiser la phagocytose.
- La microscopie TIRF s'avère efficace pour l'étude des processus cellulaires au niveau de la membrane.
- Les connaissances acquises peuvent orienter les recherches futures sur les réponses immunitaires.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La microscopie TIRF à haute résolution permet la visualisation en temps réel de la formation et de la fermeture des phagosomes, offrant ainsi des informations mécanistiques sur la phagocytose médiée par les macrophages. Cette capacité soutient les équipes de découverte précoce dans la réduction des risques liés aux hypothèses sur la fonction des cellules immunitaires et oriente la validation des cibles pour les stratégies immunomodulatrices. L'approche renforce la confiance prédictive à l'interface de la biologie cellulaire et de l'immunologie, ayant un impact direct sur les décisions portant sur les portefeuilles de développement thérapeutique ciblant le système immunitaire.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet l'observation directe du regroupement des récepteurs et des dynamiques d'actine pendant la phagocytose.
- Permet une réduction mécanistique des risques en précisant la séquence des événements cytosquelettiques et membranaires.
- Facilite la validation fonctionnelle des cibles dans les voies régulant l'ingestion par les cellules immunitaires.
- Fournit des données d'imagerie quantitative pour éclairer les décisions de poursuite ou d'abandon dans les programmes ciblant les voies immunitaires.
Développement de tests et criblage
- Établit un système validé et reproductible pour le suivi de la formation et de la fermeture de la cupule phagocytaire.
- Fournit des mesures quantitatives de fluorescence permettant la standardisation et la reproductibilité des tests.
- Permet le criblage de modulateurs affectant la polymérisation de l'actine ou la signalisation des récepteurs en temps réel.
- Permet la réutilisation de la plateforme pour évaluer diverses interactions entre cellules immunitaires et cibles opsonisées.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les dynamiques de phagocytose in vitro avec les mécanismes immunitaires pertinents pour la maladie.
- Assure une continuité entre les études mécanistiques à stade de découverte et les modèles précliniques de modulation immunitaire.
- Permet une progression ajustée au risque des candidats ciblant l'immunité, fondée sur des lectures fonctionnelles cellulaires.
- Permet l'identification de biomarqueurs translationnels grâce à l'imagerie quantitative des événements phagocytaires.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cet essai fondé sur la microscopie TIRF s'intègre dans la continuité découverte-préclinique, reliant la biologie cellulaire mécanistique à la recherche immunitaire translationnelle.
- Découverte en biologie : Met en lumière la signalisation médiée par les récepteurs et le remaniement du cytosquelette lors de la phagocytose.
- Essais de criblage : Fournit des résultats d'imagerie quantitatifs et reproductibles pour les études de perturbation par composés ou approches génétiques.
- Analyse : Permet la mesure de l'intensité de fluorescence et des dynamiques spatiales afin de comparer différentes conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre la fermeture des phagosomes in vitro et la fonction immunitaire in vivo, ainsi que le développement de biomarqueurs.
- Utilisation en entreprise : Offre une plateforme standardisée et évolutible pour les tests fonctionnels des cellules immunitaires dans divers programmes.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive concernant la fonction des cellules immunitaires et l'engagement des cibles.
- Valeur opérationnelle : Fournit des protocoles d'imagerie standardisés et reproductibles, propices à une adoption transversale entre équipes.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions d'avancement ou d'abandon et réduit les risques biologiques en phase avancée dans les portefeuilles axés sur les cibles immunitaires.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des actifs immunomodulateurs, fondée sur des preuves cellulaires fonctionnelles.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en microscopie à fluorescence avancée et en imagerie de cellules vivantes.
- Exige un accès à un équipement compatible avec la microscopie par fluorescence induite par réflexion totale (TIRF) et à un logiciel d'imagerie adapté.
- Implique une préparation standardisée des échantillons et une harmonisation des protocoles entre équipes.
- Pourrait nécessiter des adaptations selon les types de cellules immunitaires ou les particules cibles.
- Dépend d'un marquage fluorescent fiable et d'une optimisation du rapport signal sur bruit.
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Dernière mise à jour : 22 août 2026