Name: Technologie IgY: Extraction danticorps de jaune dœuf de poulet par polyéthylène glycol (PEG) Précipitations (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Apprenez l'extraction d'anticorps IgY du jaune d'œuf de poule par précipitation au polyéthylène glycol. Cette méthode simple et économique permet d'obtenir un rendement élevé d'IgY actifs pour la recherche immunologique.

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Ce travail a été soutenu par une subvention du ministère fédéral allemand de l&#39;Education et la Recherche (Projet BiGRUDI [Bi ologische G efahrenlagen: R isikobewertung, u ltraschnelle D etektion und von j&#39;ai dentifizierung bioterroristisch relevanten Agenzien, 13N9594]). Nous remercions B. Diemar (Charité-Universitätsmedizin Berlin, Institut für Pharmakologie) pour l&#39;assistance technique excellente.

1. Protocole - IgY extraction au moyen de PEG-précipitation Fig. 1 donne le schéma de la procédure d'IgY-extraction (voir tableau 2). Le protocole a été décrit pour la première à Polson et al. 1980. Toutes les mesures doivent être effectuées en utilisant des gants en latex. <ol><li> La coquille est soigneusement fissuré et le jaune est transférée à une "cuillère jaune" afin d'éliminer autant que l'œuf blanc que possible. </li><li> Le jaune est transféré à un papier filtre et roulé pour enlever les blancs d'œufs, puis la peau jaune est coupé avec une lancette ou un instrument similaire (pipette). Le jaune est versé dans un tube de 50 ml et le volume d'oeuf est enregistré (V1). </li><li> Deux fois le volume de PBS jaune d'œuf est mélangé avec le jaune (ΣV1 + V2), puis de 3,5% de PEG 6000 (en gramme, pulvérisé) du volume total est ajouté et vortexés, suivies de 10 min roulant sur une table de mixage roulant. Cette étape de la procédure d'extraction sépare la suspension en deux phases. Une phase se compose de «solides jaune et corps gras» (citation originale de Polson et al. 1980) et une phase aqueuse contenant des protéines IgY et autres. </li><li> Les tubes sont centrifugés à 4 ° C pendant 20 min (10.000 rpm en fonction de 13 000 xg, Heraeus Multifuge 3SR +, rotor à angle fixe). Le surnageant (V3) est versé à travers un filtre plissé et transféré dans un nouveau tube. </li><li> PEG 6000 de 8,5% en gramme (calculés selon le nouveau volume) sont ajoutés au tube, vortex et roulé sur une table de mixage rouler comme à l'étape 3. </li><li> Répétez l'étape 4 à la différence que le surnageant est éliminé. </li><li> Le culot est soigneusement dissous dans 1 ml de PBS à l'aide d'un bâton de verre et le Vortexer. PBS est ajouté à un volume final de 10 ml (V4). La solution est mélangée avec le PEG 6000 12% (p / v, 1,2 gramme) et traitée comme dans l'étape 3 (vortex, mélangeur de roulement). </li><li> Répétez l'étape 6 et dissoudre l'extrait soigneusement dans 800 ul de PBS (bâton de verre et de vortex). Attendre que les bulles d'air disparaissent, puis transfert (pipette) de l'extrait d'une capsule de dialyse. Rincer le tube avec 400 ul de PBS et ajouter du volume à l'appareil de dialyse (V5). (Pour la préparation d'appareils de dialyse et les membranes voir annexe). </li><li> L'extrait est dialysé pendant la nuit dans une solution saline à 0,1% (1600 ml) et agite doucement à l'aide d'un agitateur magnétique. Le lendemain matin, la saline est remplacé par du PBS et dialysée pendant encore trois heures. </li><li> Par la suite, l'AGI-extrait est tiré de la capsule de dialyse par une pipette et transférées dans des tubes de 2ml. Le volume final est d'environ 2 ml (V6). </li><li> La teneur en protéines (mg / mL) des échantillons est mesurée par photométrie à 280 nm (1:50 diluée avec du PBS) et calculé conformément à la loi de Lambert-Beer avec un coefficient d'extinction de 1,33 pour IgY (voir Fig. 2), figure . 4 montre la qualité de la préparation (pureté et de récupération sont environ 80%). </li><li> Il est conseillé de stocker les échantillons dans des aliquotes à -20 ° C (ne pas congeler les échantillons à -70 ° C). </li><li> La qualité de la préparation finale est analysé par SDS-PAGE simples tel que décrit dans le protocole JoVE <a href="https://www.jove.com/details.php?id=1916">https://www.jove.com/details.php?id=1916</a> </li></ol> 2. Annexe avant d'utiliser le sac de dialyse doit être préparé de la manière suivante selon les recommandations du fabricant: <ol><li> 20 sacs de dialyse sont découpés en morceaux de 30 cm et donnée dans un bécher de 2000 ml en verre. </li><li> 1750 ml d'une 5 mM EDTA solution sont ajoutés. </li><li> Un entonnoir en verre est placée au-dessus des sacs pour s'assurer que les sacs sont couverts par la solution d'EDTA. La solution est chauffée et bouillir pendant 5 min (plaque chauffante). La solution est décantée et les sacs sont lavées trois fois avec de l'eau distillée. </li><li> Encore une fois 1750 ml d'EDTA-solution sont ajoutés, bouillir pendant 5 min et lavées trois fois avec de l'eau distillée comme ci-dessus. </li><li> Enfin, les sacs de dialyse sont bouillis pendant 10 min dans de l'eau distillée et conservés à 4 ° C. Sortez les sacs de dialyse à l'aide d'une pince à épiler stérilisée. </li></ol> 3. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Schéma de principe d'IgY-extraction au moyen de la précipitation de polyéthylène glycol selon la description originale de Polson et al. 1980. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3084/3084largefig1.jpg">Pour afficher une image plus grande cliquez ici.</a> <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Développement du total-IgY de jaune d'oeuf de poules immunisées dans la dépendance de l'âge. Compte tenu de la moyenne hebdomadaire du total des IgY / œuf et SD (n = 4 poules pondeuses). De [Pauly et al. 2009]). <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Layicapacité de suivi de quatre poules ng immunisées avec des antigènes différents. Les flèches indiquent la date de vaccination (d'après [Pauly et al. 2009]). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3084/3084largefig3.jpg">Pour afficher une image plus grande cliquez ici.</a> <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Polyacrylamide-électrophorèse en gel de préparations IgY individuels à partir d'œufs différents dans des conditions réductrices Voie 1 - marqueur de poids moléculaire, la voie 2 - IgY standard, Lane 3-5 - échantillons différents IgY préparé comme décrit dans le protocole. Ce sont les derniers préparatifs en fonction de l'étape 10 du protocole. HC - chaînes lourdes, LC - chaines lumière,? - Impuretés mineures correspondant à poids moléculaire d'environ 35 kDa (probablement le fragment C-terminal de la vitellogénine II précurseur, [Klimentzou et al, 2006.]). <table border="1"><tbody><tr><td> </td><td> Poulet 21 (antigène A) </td><td> Poulet 22 (antigène A) </td><td> Poulet 19 (B Antigen) </td><td> Poulet 23 (C Antigen) </td></tr><tr><td> Nombre d'œufs (IgY total) 1, 2 ans la période </td><td> 625 (38 g) </td><td> 626 (38 g) </td><td> 545 (33 g) </td><td> 608 (37 g) </td></tr><tr><td> Nombre d'œufs (IgY total), la première année </td><td> 345 (20 g) </td><td> 304 (16 g) </td><td> 326 (18 g) </td><td> 308 (17 g) </td></tr><tr><td> Nombre d'œufs (IgY total), deuxième année </td><td> 280 (18 g) </td><td> 322 (21 g) </td><td> 219 (15 g) </td><td> 300 (20 g) </td></tr><tr><td> % Du max. nombre d'œufs possible (première année) 2 </td><td> 106 </td><td> 93 </td><td> 100 </td><td> 95 </td></tr><tr><td> % Du max. nombre d'œufs possible (deuxième année) </td><td> 86 </td><td> 99 </td><td> 67 </td><td> 92 </td></tr><tr><td> nombre d'œufs transformés </td><td> 565 </td><td> 620 </td><td> 283 </td><td> 401 </td></tr></tbody></table> 1 Le montant de IgY total est calculé en multipliant le nombre d'oeufs par une valeur moyenne de 60 mg de protéine par oeuf, selon les données de la figure 2. Les deux max. nombre d'œufs possibles par an est de 325 selon une information de l'éleveur. Tableau 1. Deux statistiques des années de la capacité de ponte des poules immunisées avec des antigènes différents. Pose des capacités en pour cent du maximum de quatre poules après immunisation avec des antigènes différents ainsi que l'AGI-résultat pendant deux ans (voir aussi Fig. 3), [Pauly et al. 2009]). <table border="1"><tbody><tr><td> Egg Nr. </td><td> Nr. poule. Date de ponte </td><td> V1 [ml] jaune </td><td> V2 [ml] de PBS </td><td> 1. PEG prec. [G] </td><td> Vol [ml] après </td><td> 2. PEG prec. [G] </td><td> Boulette </td><td> 3. PEG prec. [G] </td><td> Boulette </td><td> Vol [ml] </td><td> Protéines totales mg / ml </td><td> Corrigé des protéines totales mg / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 2xV1 ΣV1 + V2 </td><td> 3,5% [w / v] ΣV1 + V2 </td><td> prec. CENTRIFUGE. filtration et V3 </td><td> 8,5% [w / v] V3 </td><td> dissous dans du PBS ml V4 </td><td> 12% [w / v] V4 </td><td> Dissous dans ml de PBS V5 </td><td> Après dialyse contre du PBS V6 </td><td> A280/ml </td><td> A280/ml: 1,33 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> H293 / 22,10. </td><td> 15 </td><td> 30 45 </td><td> 1,58 </td><td> 31 </td><td> 2,63 </td><td> 10 </td><td> 1.2 </td><td> 1.2 </td><td> 1.7 </td><td> 35,0 </td><td> 26,3 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> H293 / 23,10. </td><td> 13 </td><td> 26 39 </td><td> 1,37 </td><td> 25 </td><td> 2,12 </td><td> 10 </td><td> 1.2 </td><td> 1.2 </td><td> 1.7 </td><td> 28,8 </td><td> 21,6 </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Protocole exemples de PEG précipitations

<ol><li>Akita, E. M., Nakai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+four+purification+methods+for+the+production+of+immunoglobulins+from+eggs+laid+by+hens+immunized+with+an+enterotoxigenic+E.+coli+strain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of four purification methods for the production of immunoglobulins from eggs laid by hens immunized with an enterotoxigenic E. coli strain.</a> J. Immunol. Methods. 160, 207-214 (1993).</li>
<li>De Meulenaer, B., Huyghebaert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+purification+of+chicken+egg+yolk+immunoglobulins%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Agricult.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation and purification of chicken egg yolk immunoglobulins: a review.</a> Food Agricult. Immunol. 13, 275-288 (2001).</li>
<li>Klimentzou, P., Paravatou-Petsotas, M., Zikos, C. h, Beck, A., Skopeliti, M., Czarnecki, J., Tsitsilonis, O., Voelter, W., Livaniou, E., Evangelatos, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+immunochemical+evaluation+of+antibodies+Y+for+the+poorly%2C+immunogenic+polypeptide+prothymosin+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly, immunogenic polypeptide prothymosin alpha.</a> Peptides. 27, 183-193 (2006).</li>
<li>Pauly, D., Dorner, M., Zhang, X., Hlinak, A., Dorner, B., Schade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+laying+capacity%2C+immunoglobulin+Y+concentration%2C+and+antibody+titer+development+in+chickens+immunized+with+ricin+and+botulinum+toxins+over+a+two-year+period%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science%22%5BJournal%5D)">Monitoring of laying capacity, immunoglobulin Y concentration, and antibody titer development in chickens immunized with ricin and botulinum toxins over a two-year period.</a> Poultry Science. 88, 281-290 (2009).</li>
<li>Polson, A., von Wechmar, M. B., van Regenmortel, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+viral+IgY+antibodies+from+yolks+of+immunized+hens%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Commun%22%5BJournal%5D)">Isolation of viral IgY antibodies from yolks of immunized hens.</a> Immunol. Commun. 9, 475-493 (1980).</li>
<li>Schade, R., Behn, I., Erhard, M., Hlinak, A., Staak, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchade%2C+R+%22Chicken+egg+yolk+antibodies%2C+production+and+application+%3A+IgY-Technology%22">Chicken egg yolk antibodies, production and application : IgY-Technology</a>. , Springer. Berlin. (2001).</li>
<li>Schade, R., Calzado, E. G., Sarmiento, R., Chacana, P. A., Porankiewicz-Asplund, J., Terzolo, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chicken+egg+yolk+antibodies+%28IgY-technology%29%3A+a+review+of+progress+in+production+and+use+in+research+and+human+and+veterinary+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Altern.+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): a review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine.</a> Altern. Lab Anim. 33, 129-154 (2005).</li>
<li>Witkowski, P. T., Bourquain, D. R., Hohn, O., Schade, R., Nitsche, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+gun-supported+DNA+immunisation+of+chicken+for+straightforward+production+of+poxvirus-specifiv+IgY+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Gene gun-supported DNA immunisation of chicken for straightforward production of poxvirus-specifiv IgY antibodies.</a> J. Immunol. Methods. 341, 146-153 (2009).</li>
</ol>

Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et les règlements stipulés par Landesamt für Gesundheit und Soziales de Berlin (H 0069/03).

Le choix d&#39;une méthode de purification IgY approprié est influencée par l&#39;échelle de la purification (laboratoire ou industrielle), la rentabilité, de la technologie (matériel de laboratoire), et l&#39;impact sur l&#39;environnement (gestion des déchets). Diverses méthodes d&#39;extraction ont été IgY examiné en détail par De Meulenaer &amp; Huyghebaert (2001, pour revue, voir aussi Schade et al. 2005). En général, ces méthodes peuvent être divisés en trois groupes principaux: <ol><li> Méthodes de précipitation: l&#39;implication de sulfate d&#39;ammonium ou de sodium, polyéthylène glycol (PEG), l&#39;acide caprylique et caragenean. </li><li> Les méthodes chromatographiques: chromatographie d&#39;affinité, chromatographie échangeuse d&#39;ions, chromatographie d&#39;interaction hydrophobe, la chromatographie d&#39;interaction thiophylic, et de filtration sur gel de chromatographie. </li><li> L&#39;ultrafiltration. </li></ol> La pureté d&#39;une préparation IgY peut être augmentée par une combinaison de méthodes, par exemple, le PEG précipitations peuvent être combinés avec la chromatographie d&#39;affinité. Dans certains cas, selon l&#39;application finale, un extrait d&#39;eau de IgY est suffisante pour obtenir de bons résultats (Akita &amp; Nakai, 1993). Selon notre expérience, l&#39;AGI-échantillon, nous obtenons par PEG-précipitation a très bien fonctionné dans beaucoup de différents dosages immunologiques. En standardisant la méthode de précipitation PEG-un assistant technique est capable de traiter environ 84 œufs par semaine, ce qui correspond à un montant de IgY totales entre 4 et 7 g par semaine. Un simple calcul: une poule pondeuse est immunisé avec un antigène. Après une vaccination stimuler la poule quelques produit des anticorps spécifiques (Ab) avec un titre de 1:50,000 pendant une période de 30 jours. 30 œufs x 2 ml d&#39;extrait IgY (voir protocole et Fig. 3) correspond à 60 ml IgY total, qui à son tour correspond à une dilution de Ab-3000 l (la capacité d&#39;un seau est de 10 l), ce qui signifie avec 3.000 l de la solution AB 300 seaux peuvent être remplies. Ainsi, en vue d&#39;une telle quantité énorme Ab-il pas un problème pour stocker une Ab-bassin de qualité constante et de spécificité. Cette technique réduit la variabilité de charge / lot contraire observé dans polyspécifique Ab. Malgré l&#39;aspect quantitatif, IgY Ab ont d&#39;autres avantages par rapport aux IgG des mammifères: Pas d&#39;activation du système du complément chez les mammifères, aucune réactivité croisée avec HAMA (anticorps humain anti-souris), les facteurs rhumatoïdes ou humaine antigènes de groupe sanguin (manque de heteroagglutinins). Un avantage remarquable de IgY-Ab est la distance phylogénétique dits. Distance phylogénétique est la raison pour laquelle les différences entre les décrit souvent les spécificités Ab des mammifères et des poules, même lorsque l&#39;identique vaccinés. En plus de différences entre les mammifères et le système immunitaire aviaire eux-mêmes, les différences dans le développement phylogénétique de ces deux classes d&#39;animaux contribue aux spécificités différentes Ab. Plusieurs auteurs ont rapporté que les poulets produisent souvent Abs contre phylogénétiquement très conservées des protéines de mammifères ou des peptides plus efficacement que ne le lapin (pour revue, voir Schade et a. 2005). En conséquence, un antigène conservé peut rester &quot;masqués&quot; pour le système de lapin immunitaire, et provoquer ainsi qu&#39;une faiblesse ou un &quot;silence&quot; de réponse. Par ailleurs, si les poulets et les lapins sont immunisés avec le même antigène de mammifères, très souvent les poulets répondre avec un Ab-spécificité qui peut rarement être obtenue chez le lapin. Aussi l&#39;aspect de bien-être animal est important puisque les Ab sont non invasive extrait de jaune d&#39;oeuf. En combinaison avec Gene-Gun (plasmide) vaccination de l&#39;IgY-production est totalement non-invasive (Witkowski et al. 2009). En conclusion, la production d&#39;Ab dans les poules et les IgY extraction au moyen de PEG-précipitation est très rentable et les résultats dans Ab très spécifique avec des titres stables jusqu&#39;à 1:1,000,000. En raison de la distance phylogénétique entre Aves et Mammalia, de poulet sont capables de produire Ab spécifiques contre les antigènes hautement conservée chez les mammifères, contrairement aux lapins par exemple. La quantité extraordinaire d&#39;Ab obtenus par IgY technologie ouvre la porte aussi à l&#39;aide IgY-Ab dans la médecine humaine et vétérinaire à des fins thérapeutiques / prophylactiques.

<ol><li> Dialyse Visking sac, de type 27/32, coupé -14 kD, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Allemagne </li><li> Tubes Falcon Blue Max, 50 ml en polypropylène Tube conique, Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes NY, USA </li><li> Filtre plissé MN 615 ¼, ∅ 150 mm, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Allemagne Heraeus </li><li> Agitateur magnétique, Variomag Mono, H + P Labortechnik AG, Oberschleißheim, Allemagne </li><li> Micro-Dialyse-Capsule 5,0 ml, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Allemagne </li><li> Multifuge 3SR +, Thermo Scientific, Langenselbold, Allemagne </li><li> Photomètre UV-160A, Shimadzu Deutschland GmbH, Duisburg, Allemagne </li><li> Le polyéthylène glycol 6000, Rotipuran Ph. Eur., Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Allemagne </li><li> Prémélangé PBS-Buffer 10x, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Allemagne </li><li> Rouleau Mixer SRT2, Stuart, dans le Staffordshire, Royaume-Uni </li><li> Vibrofix VF2, Janke &amp; Kunkel, IKA-Labortechnik, Staufen-en-Brisgau, Allemagne </li><li> Cuillère Jaune, Fackelmann (effets houshold), Allemagne </li></ol>

technologie igy: extraction d&#39;anticorps de jaune d&#39;œuf de poulet par polyéthylène glycol (peg) précipitations

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol (PEG) Precipitation

Les poules peuvent être immunisés par la vaccination au moyen d&#39;im (Musculus pectoralis, gauche et droite, le volume d&#39;injection 0,5-1,0 ml) ou par l&#39;intermédiaire de Gene-Gun plasmide-immunisation. Charge sur l&#39;immunogénicité de l&#39;antigène, d&#39;anticorps de haute-titres (jusqu&#39;à 1:100.000 - 1:1,000,000) peuvent être obtenus après seulement une ou 3 - 4 immunisations stimuler. Normalement, une poule pond des oeufs en continu pendant environ 72 semaines, par la suite la capacité diminue de pose. Ce protocole décrit l&#39;extraction des IgY totale de jaune d&#39;œuf par le biais d&#39;une procédure de précipitations (PEG. Polson et al. 1980). La méthode comporte deux étapes importantes. Le premier est l&#39;élimination des lipides et la seconde est la précipitation de l&#39;IgY totale à partir du surnageant de la première étape. Après dialyse contre un tampon (PBS normalement) l&#39;AGI-extrait peut être conservé à -20 ° C pendant plus d&#39;un an. La pureté de l&#39;extrait est d&#39;environ 80%, le total des IgY par oeuf varie de 40-80 mg, dépendant de l&#39;âge de la poule pondeuse. Les augmentations de la teneur totale en IgY avec l&#39;âge de la poule d&#39;environ 40 mg / oeuf jusqu&#39;à 80 mg / oeuf (concernant le PEG précipitations). La capacité de ponte d&#39;une poule par an est d&#39;environ 325 œufs. Cela signifie une récolte totale potentielle de 20 g au total IgY / an basé sur un contenu IgY moyenne de 60 mg d&#39;œuf IgY / total (voir tableau 1).

Ce protocole décrit notamment l&#39;extraction de IgY totales du jaune d&#39;oeuf par précipitation de polyéthylène glycol et donne des informations générales sur la technologie IgY.

Technologie IgY: Extraction d&#39;anticorps de jaune d&#39;œuf de poulet par polyéthylène glycol (PEG) Précipitations

Les poules peuvent être immunisées par vaccination i.m. (Musculus pectoralis, gauche et droit, volume d'injection 0,5-1,0 ml) ou au moyen d'un canon à gènes (Gene-Gun)...

Ce vidéo montrera l'isolement des anticorps IgY provenant de poules, qui peuvent être immunisées soit avec le gène du chewing-gum, un plasmide, soit de manière plus traditionnelle par injection intramusculaire. Tout d'abord, le jaune d'œuf est isolé. Ensuite, les lipides sont précipités, suivis par une précipitation de la fraction protéique contenant les anticorps, qui sont ensuite isolés lors d'une étape supplémentaire de précipitation.Enfin, les anticorps sont dialysés contre le PBS. Oui. Bonjour. Je m'appelle Ard. Voici mon collègue, Adema, et nous travaillons ici à l'Institut de pharmacologie, très ancien et célèbre, qui appartient à la Médecine universitaire SHA de Berlin.Et dans ce qui suit, nous aimerions vous montrer l'extraction de l'IGY à partir du poulet, de l'œuf, du yaourt, selon une méthode très, très simple et également très économique. L'ensemble appartient à la technologie dite de l'IGY. La première étape de la préparation de l'IGY est l'isolement du jaune d'œuf.Pour cette procédure, nous avons besoin de porte-tubes, de papier filtre à embouts bleus, de pointes de pipette, de tampon, d’un bécher en verre, d’une cuillère pour séparer le jaune du blanc d’œuf, et bien sûr, des œufs. L’œuf est cassé au-dessus de la cuillère à jaune pour évacuer le blanc. Ensuite, la cuillère contenant le jaune est doucement agitée afin d’éliminer la majeure partie du blanc d’œuf.Le jaune est ensuite transféré sur du papier filtre afin d'éliminer les protéines du blanc d'œuf aussi complètement que possible. La membrane du jaune est très stable dans les œufs conservés depuis moins d'un mois ; après une conservation de plus de trois mois, elle devient instable. La membrane du jaune peut se rompre en raison du processus de vieillissement lors du roulage sur le papier filtre.Ensuite, la membrane du jaune est ouverte à l’aide d’une pipette et transférée dans un tube. Enfin, on observe que le jaune présente un volume d’environ 15 millilitres. Ce volume est normal chez une poule pondeuse adulte et ne varie que très peu.Le volume de jaune est enregistré. Du polyéthylène glycol à 3,5 % est utilisé comme précipitant dans un tampon PBS afin de séparer les protéines du jaune, notamment l'IGY, des lipides présents dans le jaune d'œuf. 1,58 gramme de polyéthylène glycol, correspondant à 3,5 % du volume final de jaune et de tampon, est pesé sur une balance. Les 15 millilitres de jaune sont mélangés avec deux fois le volume de tampon PBS, ainsi 30 millilitres de PBS sont ajoutés pour un volume final de 45 millilitres. Le polyéthylène glycol est ensuite ajouté au mélange.Le tube est bouché, puis vortexé vigoureusement pendant 20 à 30 secondes. Inverser périodiquement le tube pendant la procédure de vortexage.Après agitation vortex, le jaune doit être complètement en suspension. Les tubes sont ensuite placés sur un agitateur rotatif pendant 10 minutes. Le résultat est un mélange homogène dont la couleur a changé, passant du jaune au jaune clair.La mixture est maintenant centrifugée pendant 20 minutes. La centrifugation permet de séparer un surnageant clair contenant l'IGY et d'autres protéines d'un précipité jaune, composé principalement de lipides. À l'étape suivante, le surnageant S est versé à travers un filtre plissé et transféré dans un nouveau tube.Le nouveau volume est noté et le précipité est éliminé. À présent, du polyéthylène glycol est à nouveau ajouté au surnageant à une concentration finale de 12 %, ce qui correspond à 3,5 % lors de la première précipitation, plus 8,5 % du volume du surnageant résultant, donnant ainsi 12 %. Ensuite, la solution est agitée, incubée sur un mélangeur rotatif comme précédemment, puis centrifugée pendant 20 minutes. À ce stade, le polyéthylène glycol précipite l'IgY et d'autres protéines.Après cette étape de centrifugation, le culot sera utilisé pour la préparation de la dissolution. Les bâtonnets de verre du culot sont désinfectés avec de l'éthanol à 70 % ; pendant le séchage des bâtonnets, le surnageant S est éliminé. Le tube est ensuite retourné pour éliminer le reste du surnageant.Un millilitre de PBS est ensuite ajouté au culot. Le culot est dissous à l’aide de la baguette en verre tout en vortexant soigneusement. Vous obtenez maintenant une solution légèrement jaune.À présent, du PBS est ajouté jusqu'à un volume final de 10 millilitres, suivi d'une troisième précipitation par le polyéthylène glycol à une concentration de 12 %, comme précédemment, contrairement à la seconde centrifugation. Cette fois, un précipité blanc est obtenu après centrifugation pendant 20 minutes. Le culot est redissous de la même manière qu'auparavant, mais en deux étapes.Dans la première étape, on la dissout dans 0,8 millilitre de PBS et on la transfère dans une capsule de microdialyse. Ensuite, on rince le tube avec 0,4 millilitre supplémentaire de PBS, que l'on transfère également dans la capsule. À l'étape suivante, on coupe un sac de dialyse avec des ciseaux désinfectés et on le rince à l'eau distillée.Le sac de dialyse est ensuite placé sur la partie inférieure de la capsule et fermé hermétiquement par la partie supérieure. Enfin, les capsules sont transférées dans un bécher en verre placé sur un agitateur magnétique. La solution d'IGY est dialysée toute la nuit contre une solution saline à 0,1 %.Le lendemain, la solution d'IGY est dialysée pendant trois heures contre du PBS. Une fois la dialyse terminée, la membrane de dialyse est perforée à l’aide d’un embout de pipette et la solution d'IGY est récupérée et transférée dans un petit tube. Le volume final est noté.Le produit final est une solution limpide, qui peut être conservée à moins 20 degrés Celsius pendant plusieurs années. Selon notre expérience, n'entreposez pas la préparation d'IGY à moins 70 degrés Celsius, car nous avons observé une perte importante d'activité à cette température. Eh bien, j'espère que nous avons réussi à vous convaincre que l'extraction d'IDY à partir d'un a est une procédure vraiment simple et efficace lorsqu'on suit notre protocole.Le matériel nécessaire est minimal, et nous pensons qu'il existe un bon rapport entre l'effort et les bénéfices. J'espère que cette publication vidéo vous encouragera à bien utiliser notre protocole ainsi que la technologie, comme je le ferai. Merci.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Dans cette vidéo, nous démontrons l’immunoprécipitation par anticorps des phosphopeptides à partir d’un mélange de peptides. Les phosphopeptides enrichis sont concentrés sous vide et stockés pour l’analyse en aval.

Enrichissement en phosphopeptides : une technique d’immunoprécipitation à base d’anticorps pour séparer des peptides phosphorylés spécifiques de mélanges complexes de peptides

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