Encyclopédie des expériences JoVE
Immunologie
0 vues • 3:22 min • July 8th, 2025
Commencez avec un tube contenant des vecteurs distincts pour les gènes des anticorps à chaîne lourde et à chaîne légère.
Ajouter un réactif de transfection pour former des complexes avec les vecteurs.
Transférez ce mélange dans des cellules hôtes de mammifères et incubez pour l’internalisation.
Ajoutez un agent anti-agglomérant pour favoriser la distribution uniforme des cellules transfectées, améliorant ainsi la récupération et la croissance cellulaires.
Ajoutez une solution anti-bactérienne-anti-mycosique pour éviter la contamination.
À l’intérieur de la cellule hôte, les vecteurs s’intègrent dans le génome de l’hôte.
Après la transcription des gènes, les ARNm individuels sortent du noyau et subissent une traduction pour former des chaînes d’anticorps naissantes.
Le pliage et la modification appropriés des chaînes naissantes produisent des chaînes lourdes et légères.
Ces chaînes se combinent pour former des anticorps entièrement fonctionnels, qui sont ensuite libérés dans le milieu extracellulaire.
Récoltez le milieu et centrifugez-le. Filtrez le surnageant.
Passer le filtrat à travers une colonne de purification qui permet une liaison sélective des anticorps.
À l’aide d’un tampon d’élution, éluer les anticorps purifiés.
Cultivez des cellules CHO dans 200 millilitres de milieu dans de longs flacons à chicanes Erlenmeyer. Combinez 5 millilitres de média freestyle CHO avec 50 microgrammes d’ADN de clone lourd variable et 75 microgrammes d’ADN de clone léger variable dans un tube de 15 millilitres. Ensuite, faites tourbillonner le tube. Laissez le mélange à température ambiante pendant 5 minutes. Ajoutez 750 microlitres de stock de polyéthylène amine de 1 milligramme par millilitre à la solution d’ADN et agitez-le agressivement pendant 30 secondes.
Laissez le mélange à température ambiante pendant 5 minutes supplémentaires. Ajoutez le tout du mélange dans les cellules CHO tout en secouant manuellement la fiole. Incuber immédiatement les cellules à 37 degrés Celsius tout en secouant à 130 tr/min.
Le lendemain, ajoutez 2 millilitres d’agent anti-agglomérant 100x et 2 millilitres de solution antimycosique antibactérienne 100x aux cellules. Incuber les flacons à 32 à 34 degrés Celsius en secouant à 130 tr/min. Continuez à cultiver les cellules pendant 10 à 11 jours, en ajoutant 10 millilitres de tryptone N1 et 2 millilitres de supplément de glutamine 100x tous les cinq jours. Comptez les cellules tous les trois jours pour vous assurer que la viabilité cellulaire reste supérieure à 80 %. Le jour 10 ou 11, récoltez le milieu pour la purification des anticorps en centrifugeant la culture à 3 000 fois g et 4 degrés Celsius pendant 40 à 60 minutes. Ensuite, filtrez le média transparent avec un filtre à bouteille de 0,22 micromètre.
Pour purifier les anticorps, équilibrez la colonne de protéine A avec deux volumes de colonne de tampon de liaison. Passez le média filtré à travers la colonne à un débit de 1 millilitre par minute. Ensuite, lavez la colonne avec deux volumes de colonne de tampon de liaison. Utilisez 5 millilitres de tampon d’élution pour éluer l’anticorps en fractions de 500 microlitres.