Génération de variants d’échappement du virus de la grippe contre les anticorps neutralisants

Prenez une suspension de virus de la grippe, contenant à la fois des souches de type sauvage et mutantes.

Une glycoprotéine d’enveloppe virale appelée hémagglutinine, ou HA, se lie à l’acide sialique à la surface de la cellule hôte, médiant l’entrée virale.

Ajoutez un anticorps neutralisant à des concentrations décroissantes qui se lie à l’HA, bloquant le site de liaison de l’acide sialique.

Les souches mutantes, porteuses de mutations dans l’HA qui aident à éviter la neutralisation des anticorps, sont appelées variantes d’échappement.

Injectez le mélange dans des œufs de poule embryonnés exempts d’agents pathogènes, en libérant les virus dans le liquide allantoïde, et incubez.

Les

virus neutralisés par anticorps ne peuvent pas pénétrer dans les cellules de la membrane chorioallantoïde. Les virus mutants non neutralisés pénètrent dans les cellules, se répliquent et sont libérés dans le liquide allantoïde.

Récoltez la population virale contenant du liquide allantoïde.

Introduire un anticorps spécifique de l’HA à des concentrations décroissantes, qui neutralise les autres souches à l’exception des variants d’échappement.

Les variants d’échappement non neutralisés se lient aux cellules, provoquant l’agglutination des globules rouges - appelée hémagglutination, confirmant la génération de variants d’échappement.

Les anticorps neutralisants qui ont une activité HI sont analysés plus en détail en préparant d’abord 4 dilutions de l’anticorps d’intérêt en augmentant les concentrations dans 1 fois PBS dans un volume de 100 microlitres par dilution. Ensuite, préparez un stock de virus de 1 million d’unités formant des plaques par millilitre dans 1 fois PBS dans un volume de 400 microlitres.

Ensuite, mélangez 100 microlitres de 1 million d’unités formant de plaque par millilitre de virus avec 100 microlitres de chaque dilution d’anticorps ou 100 microlitres de 1 fois PBS. Incuber les échantillons pendant une heure dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.

Après un bref vortex, injectez 200 microlitres de chaque mélange dans des œufs de poule embryonnés exempts d’agents pathogènes spécifiques. Ensuite, incubez les œufs à 37 degrés Celsius sans dioxyde de carbone pendant 40 à 44 heures. Après l’incubation, sacrifiez les œufs embryonnés infectés par le virus en les plaçant à 4 degrés Celsius pendant au moins 6 heures. Ensuite, récoltez le liquide allantoïdien des œufs comme décrit précédemment.

Enfin, confirmez les variantes d’échappement en effectuant le test HI comme décrit dans le protocole texte.