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Immunologie
0 vues • 2:10 min • July 8th, 2025
Préparez un mélange de transfection en ajoutant un polymère cationique approprié et des vecteurs plasmidiques séparés pour les gènes d’anticorps à chaîne lourde et à chaîne légère.
Le polymère chargé positivement se lie aux plasmides chargés négativement, formant des complexes.
Ajoutez ce mélange de transfection à une plaque multi-puits contenant une culture de cellules rénales embryonnaires humaines dans un milieu sans sérum et incubez.
Les complexes pénètrent dans les cellules par endocytose, provoquant un gonflement et une rupture endosomiques, les libérant dans le cytoplasme.
Le polymère cationique produit des pores dans la membrane nucléaire, facilitant l’entrée des vecteurs et permettant leur transcription, suivie de leur traduction en protéines à chaînes lourdes et légères.
Ces protéines se déplacent vers le réticulum endoplasmique, où les protéines à chaîne lourde et légère sont dimérisées et liées de manière covalente par des liaisons disulfure, formant des anticorps.
Les anticorps se déplacent vers l’appareil de Golgi pour des modifications post-traductionnelles supplémentaires et sont emballés dans des vésicules pour une libération extracellulaire.
Prélevez le milieu contenant les anticorps libérés. Ajoutez un milieu sans sérum pour une génération continue d’anticorps.
Préparez les cellules HEK dans du DMEM supplémenté et faites-les croître jusqu’à 75 % de confluence dans des flacons de culture de 75 centimètres carrés. Pour chaque transfection de chaîne lourde/légère, préparez un mélange avec 1,75 millilitres de DMEM sans sérum. Inclure 4,5 microgrammes de vecteur à chaîne lourde, 3 microgrammes de vecteur à chaîne légère et 50 microlitres de solution de polyéthylénimine. Ajoutez doucement ce mélange dans une plaque de cellules HEK et faites tourner la solution sur la plaque.
Incuber la plaque pendant la nuit, puis commencer à collecter le milieu de culture tous les jours, en le remplaçant par un milieu sans sérum. Le milieu contient les anticorps et peut être collecté quotidiennement pendant quatre jours.