Encyclopédie des expériences JoVE
Immunologie
0 vues • 3:32 min • July 8th, 2025
Prenez une suspension de cellules tueuses naturelles, ou NK.
Ajoutez des anticorps monoclonaux anti-CD20 et incuberez.
En l’absence de cellules cancéreuses cibles exprimant l’antigène CD20, la région Fc des anticorps se lie aux récepteurs FcγRIIIa à la surface des cellules NK.
Après l’incubation, ajoutez un milieu réfrigéré. Centrifugez et éliminez les anticorps non liés.
Ensuite, ajoutez des anticorps anti-chaînes légères κ humaines. Couver.
Ces anticorps secondaires se lient à la chaîne légère κ des anticorps monoclonaux.
La réticulation de l’anticorps imite la liaison de l’antigène cible, déclenchant une cascade de signalisation intracellulaire.
Cela provoque une stimulation artificielle des cellules NK en l’absence de cellules cancéreuses.
Les cellules NK activées subissent un réarrangement cytosquelettique et libèrent des granules cytotoxiques.
De plus, les cellules produisent des chimiokines et des cytokines.
Après la durée souhaitée, ajoutez un milieu réfrigéré pour arrêter la stimulation cellulaire.
Centrifugez le tube. Prélever le surnageant et la pastille cellulaire pour l’analyse en aval des fonctions des cellules NK effectrices médiées par des anticorps.
Distribuez 100 microlitres de cellules tueuses naturelles remises en suspension dans des tubes de 1,5 millilitre ou une plaque à fond en U de 96 puits, et placez les cellules sur de la glace. Préparez du rituximab ou un autre anticorps d’intérêt à une concentration de 100 microgrammes par millilitre.
Ajoutez 1 microlitre dans chaque tube de cellules pour une concentration finale de 1 microgramme par millilitre, et incubez les cellules sur de la glace pendant 30 minutes. Pendant l’incubation, préparer une solution d’anticorps anti-kappa à chaîne légère humaine dans un milieu à une concentration de 50 microgrammes par millilitre. La quantité de solution d’anticorps nécessaire sera de 50 microlitres par échantillon de cellule.
Réchauffez la solution d’anticorps à 37 degrés Celsius sur un bloc chauffant ou dans un bain-marie. Lorsque l’incubation des cellules est terminée, ajoutez 1 millilitre de milieu glacé dans chaque tube et centrifugez les cellules à 135 fois g et 4 degrés Celsius pendant 5 minutes. Lavez à nouveau les cellules avec 1 millilitre de média glacé. Aspirez le surnageant après le dernier lavage et ajoutez 50 microlitres de la solution d’anticorps à chaîne légère kappa anti-humaine pour activer les cellules. Placez immédiatement les échantillons de cellules à 37 degrés Celsius sur un bloc de chaleur ou dans un bain-marie et incubez-les jusqu’aux points de temps souhaités pour l’analyse ou d’autres procédures.
La meilleure façon de manipuler plusieurs échantillons est d’utiliser un support flottant dans un bain d’eau à 37 degrés, qui peut être retiré et placé sur de la glace pour arrêter immédiatement toutes les réactions.