Technique de génération d’anticorps monoclonaux à partir de lymphocytes B spécifiques de l’antigène

Prenons l’exemple de vecteurs d’expression eucaryotes, codant soit pour une chaîne lourde d’anticorps, soit pour une chaîne légère d’anticorps, clonée à partir de lymphocytes B spécifiques de l’antigène.

Introduisez de la polyéthylénimine, un polymère cationique, qui interagit électrostatiquement avec les vecteurs chargés négativement, formant des polyplexes.

Incuber des cellules de mammifères avec les polyplexes, qui adhèrent aux cellules et sont internalisés par endocytose. Les endosomes qui en résultent fusionnent avec les lysosomes.

Les polymères contenus dans les polyplexes provoquent un gonflement osmotique de la vésicule, entraînant sa rupture et la libération des vecteurs.

Les vecteurs libérés pénètrent dans le noyau et sont transcrits en ARNm à chaîne lourde et à chaîne légère, qui subissent une traduction via les ribosomes sur le réticulum endoplasmique.

Les chaînes peptidiques résultantes s’assemblent en anticorps, qui sont transportés vers le Golgi et emballés dans des vésicules sécrétoires.

Lors de la fusion des vésicules sécrétoires et de la membrane cellulaire, les anticorps sont libérés extracellulairement.

Récolter le surnageant contenant des anticorps pour les tests en aval.

Semez 15 000 cellules rénales embryonnaires humaines dans 200 microlitres de milieu Eagle modifié de Dulbecco complété par 10 % de sérum de veau fœtal dans chaque puits d’une plaque à fond plat de 96 puits, un jour avant la transfection. Ensuite, incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant la nuit à 5 % de dioxyde de carbone. Cotransfectez les cellules à l’aide d’un réactif de transfection dérivé linéaire de la polyéthylèneimine. Diluez 0,5 microlitre de réactif de transfection d’ADN avec 10 microlitres de 150 millimolaires de chlorure de sodium.

Ensuite, diluez 0,125 microgramme de chaque vecteur exprimant des chaînes lourdes et légères variables dans 10 microlitres de chlorure de sodium de 150 millimolaires. Vortex toutes les dilutions pendant 10 secondes chacune. Ensuite, mélangez le réactif de transfection d’ADN préalablement dilué avec 10 microlitres de solution d’ADN. Agitez rapidement le mélange de transfection de l’ADN pendant 15 secondes et incubez pendant 15 minutes à température ambiante.

Ajoutez le mélange de transfection d’ADN goutte à goutte sur les cellules, puis faites tourner doucement la plaque. Remplacez le milieu 16 heures après la transfection et cultivez les cellules pendant cinq jours dans un milieu sans sérum à 37 degrés Celsius.