Encyclopédie des expériences JoVE
Immunologie
0 vues • 2:28 min • July 8th, 2025
Prenez une colonne FPLC contenant une résine de verre poreuse avec de la protéine A immobilisée - une protéine bactérienne se liant aux anticorps. Équilibrez la colonne avec un tampon de pH neutre.
Ajoutez du liquide de culture cellulaire récolté sur des cellules ovariennes de hamster chinois, contenant des anticorps monoclonaux et contaminant les protéines et l’ADN.
La protéine A se lie à la région Fc de l’anticorps, les immobilisant.
Certains contaminants se fixent de manière non spécifique à la résine, tandis que le reste s’écoule.
Dans le chromatogramme, une absorbance UV accrue pendant le chargement de l’échantillon indique une concentration élevée de protéines dans le flux.
Laver avec le tampon d’équilibrage pour éliminer les contaminants non liés, indiqués par une diminution de l’absorbance.
Rincer avec un tampon à haute teneur en sel, en perturbant les interactions non spécifiques et en éliminant les contaminants, indiqués par un petit pic d’impuretés.
Ajoutez un tampon d’élution à faible pH pour perturber l’interaction entre la protéine A et les anticorps et éluer les anticorps, qui sont collectés en suivant le pic correspondant.
Neutraliser le pH des anticorps collectés pour éviter la dégradation.
Commencez par ouvrir le logiciel attaché au système de purification et placez des tubes coniques de 15 millilitres pour recueillir l’éluat d’anticorps purifié, et des tubes coniques de 50 millilitres pour recueillir le passage pendant le lavage à haute teneur en sel dans le collecteur de fractions.
Ensuite, ajoutez du liquide de culture cellulaire récolté filtré par des pores de 0,22 micromètre dans une seringue vide de 12 millilitres avec une buse bouchée. Après avoir retiré le bouchon, insérez la buse de la seringue dans l’orifice d’injection manuelle du système de purification. Tournez la seringue pour la serrer en place et appuyez sur le piston jusqu’à ce que tout le volume de l’échantillon ait été injecté et soit visible dans la boucle d’échantillon de grand volume de 10 millilitres attachée.
Sélectionnez la méthode enregistrée et cliquez sur Exécuter lorsque le logiciel de l’instrument vous y invite. Lorsque tous les anticorps ont été élués, neutralisez immédiatement la protéine purifiée avec 1 base molaire à un pH d’environ 5,5.