Un test pour détecter les auto-anticorps dans le sérum humain à l’aide d’une culture neuronale de l’hippocampe

Prenez l’embryon d’hippocampe de rat.

Ajouter la trypsine. Incuber pour médier la dégradation de la matrice tissulaire, relâcher les cellules de l’hippocampe.

Diluer avec un tampon. Incuber pour une digestion enzymatique continue avec de la trypsine.

Ensuite, transférez la masse tissulaire dans un tube contenant un support. Pipette à plusieurs reprises pour la dissociation mécanique en cellules uniques.

Cellules de semence sur des lamelles enrobées de poly-L-lysine à l’intérieur de plaques de culture.

couver. Les cellules de l’hippocampe adhèrent aux surfaces revêtues. Les neurones développent une lamelle et prolongent les névrites mineurs.

De plus, les neurites se développent avec des processus axonaux et dendritiques, formant un réseau neuronal.

Les neurones matures expriment des récepteurs excitateurs synaptiques, des récepteurs N-méthyl-D-aspartate ou NMDAR.

Après l’incubation, laver les lamelles avec un support.

Ajouter un sérum dilué pour un patient atteint d’encéphalite auto-immune. Les auto-anticorps se lient aux NMDAR neuronaux.

Lavez avec un tampon puis fixez les cellules.

Ajoutez des anticorps secondaires marqués au fluorophore qui se lient aux auto-anticorps liés au NMDAR.

Laver avec un tampon. Placez la lamelle sur le support de montage contenant du DAPI pour colorer les noyaux.

Observer au microscope les signaux de fluorescence sur les neurones, indiquant la présence d’auto-anticorps dans le sérum.

Pour la dissociation enzymatique de l’hippocampe à 1 millilitre de trypsine à 2,5 % dans le tube de 50 millilitres contenant l’hippocampe, après avoir porté le volume dans le tube à 5 millilitres avec HBSS, incubez le tube pendant 15 minutes dans le bain-marie à 37 degrés Celsius. Pour diluer davantage la trypsine, ajoutez 10 millilitres de HBSS préchauffé et remettez le tube dans le bain-marie réglé à 37 degrés Celsius pendant 5 minutes.

Ensuite, utilisez une micropipette de 1 000 microlitres pour transférer l’hippocampe apparaissant comme une masse muqueuse dans un tube de 50 millilitres, et incubez le tissu avec 6 millilitres de HBSS préchauffé pendant 5 minutes, comme démontré. Pour dissocier mécaniquement le tissu, transférez la masse hippocampique dans un tube de 2 millilitres à fond conique. Après avoir ajouté 1 millilitre de média DMEM préchauffé, homogénéisez la pastille à l’aide d’une micropipette de 1 000 microlitres en aspirant doucement de haut en bas.

En veillant à ne pas créer de bulles, répétez l’aspiration de haut en bas 10 à 20 fois avec une pipette en verre pré-tirée, avec sa pointe en contact avec le fond conique du tube, jusqu’à ce que le mélange soit translucide. Comptez les cellules avant de les répartir uniformément sur une parabole de 3,5 centimètres avec des mouvements de secousses croisées. Une fois cela fait, placez le plat dans l’incubateur avec 5 % de dioxyde de carbone.

Pour l’immunomarquage fluorescent de cellules in vitro de 14 jours, ajoutez l’échantillon contenant des anticorps anti-NMDAR aux lamelles et incubez à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Au bout d’une heure, traitez l’échantillon avec du formaldéhyde à 4 % dans du PBS, comme solution de fixation, à température ambiante pendant 5 minutes. Ensuite, lavez l’échantillon trois fois avec du PBS pendant 5 minutes chacune, puis ajoutez de l’anticorps secondaire de chèvre anti-humain Alexa Fluor 488 à 1 à 1 000 dilution pendant 1 heure à température ambiante. Ensuite, montez les lamelles contenant l’échantillon avec un support de montage de liquide et aspirez tout liquide restant.