Un test pour mesurer le titre d’anticorps neutralisants spécifiques du virus respiratoire syncytial

Prenez du sérum humain dilué en série, inactivé par la chaleur, contenant du virus respiratoire syncytial ou des anticorps neutralisants spécifiques du VRS.

Ajouter la suspension virale. Les anticorps neutralisent les virus en fonction de la dilution.

Introduire le mélange dans les monocouches de cellules épithéliales humaines et incuber pour l’adsorption virale.

Jetez le mélange. Ajouter un milieu contenant de la carboxyméthylcellulose, formant une couche semi-solide. Couver.

Le VRS utilise la machinerie de la cellule hôte pour synthétiser l’ARN et les protéines virales, qui s’assemblent ensuite et bourgeonnent sous forme de virions individuels.

Les cellules infectées finissent par mourir. La carboxyméthylcellulose limite le mouvement du virus, provoquant une infection localisée et la mort cellulaire, formant des plaques.

Retirez la superposition.

Fixez les cellules avec un tampon contenant de l’acétone. Introduisez un tampon bloquant contenant un détergent pour perméabiliser les cellules et empêcher les interactions d’anticorps non spécifiques.

Ajoutez des anticorps primaires ciblant les protéines virales.

Superposition avec des anticorps secondaires conjugués aux fluorophores ciblant les anticorps primaires.

Imagez les puits pour quantifier les plaques fluorescentes.

La dilution sérique la plus élevée, neutralisant cinquante pour cent du VRS, représente le titre de neutralisation.

Avant l’inoculation des cellules A549 avec le VRS, examinez la plaque cellulaire au microscope optique pour confirmer que les monocouches cellulaires A549 sont confluentes à 80 %. Ensuite, retournez doucement l’assiette pour jeter le support et épongez légèrement l’assiette sur une serviette en papier stérile et absorbante. Après chaque lavage avec du PBS filtré et stérile.

Ensuite, ajoutez 100 microlitres par puits du mélange virus-sérum aux puits correspondants sur la plaque cellulaire A549 selon le modèle de plaque fourni dans le manuscrit, et incubez la plaque à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone pendant une heure. À la fin de l’incubation, à l’aide d’une pipette, prélever 90 microlitres par puits et ajouter 100 microlitres de milieu contenant 1X M 199, 1,5 % de CMC et 2 % de FCS et un mélange de pénicilline et de streptomycine. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone pendant trois jours.

Pour fixer et développer une plaque de test, inversez d’abord doucement la plaque cellulaire A549 infectée par le VRS pour jeter le milieu contenant du M 199, du CMC, du FCS à 2 % et un mélange de pénicilline et de streptomycine. Ensuite, ajoutez lentement 200 microlitres de tampon de fixation dans chaque puits. Incuber l’assiette à moins 20 degrés Celsius pendant 20 minutes. Ensuite, jetez le tampon de fixation et épongez doucement sur une serviette en papier absorbante.

Laissez sécher la plaque face vers le bas pendant 10 minutes. Ensuite, avec un tampon PBS filtré contenant 0,05 polysorbate-20, préparez une solution de blocage du lait à 5 %. Ajoutez 200 microlitres de solution de blocage dans chaque puits et incubez la plaque à température ambiante pendant 30 minutes. À la fin de l’incubation, retournez doucement l’assiette pour jeter la solution et épongez sur une serviette en papier absorbante.

Pour fabriquer l’anticorps primaire, diluez 1 à 500 anticorps anti-VRS de chèvre X dans la solution bloquante. Ajoutez 50 microlitres dans chaque puits et incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant une heure. Lavez la plaque trois fois avec du polysorbate PBS filtré.

Ensuite, fabriquez l’anticorps secondaire en diluant 1 à 5 000 immunoglobulines G anti-chèvres AlexaFluor Donkey dans la solution bloquante. Ajoutez 50 microlitres dans chaque puits et incubez à 37 degrés Celsius pendant une heure. Lavez la plaque cinq fois avec du polysorbate PBS filtré.

Pour compter les plaques avec un lecteur de spots automatisé, utilisez d’abord une plaque de culture à 96 puits inutilisée pour calibrer l’instrument en entrant les paramètres de comptage dans le canal FITC. Ensuite, lisez la plaque cellulaire, enveloppez-la dans du papier d’aluminium et conservez-la à 4 degrés Celsius. Ensuite, vérifiez les images des puits pour les plaques artificielles ou les monocouches cellulaires perturbées, et excluez les puits avec des monocouches cellulaires perturbées.