Tests biophysiques pour sonder les propriétés mécaniques du noyau cellulaire interphase: Application Strain Substrat et manipulation Microneedle

L'objectif général des expériences suivantes est de mesurer les propriétés mécaniques de l'interface entre le noyau cellulaire et sa connexion physique avec le cytosquelette environnant. Ceci est réalisé en appliquant une contrainte mécanique à des cellules cultivées sur une membrane en silicone transparente et en observant les déformations nucléaires induites. Des déformations nucléaires accrues correspondent à une rigidité nucléaire réduite, car des modifications du couplage nucléocytoplasmique peuvent également influencer les déformations nucléaires induites.

La transmission des forces intracellulaires entre le cytosquelette et le noyau est analysée directement en appliquant une déformation localisée au cytosquelette. Le déplacement de structures nucléaires NU et du cytosquelette marquées au moyen de fluorochromes est ensuite observé par imagerie. Les résultats obtenus illustrent la rigidité des noyaux cellulaires par rapport au cytosquelette environnant.

Sur la base des expériences de déformation du substrat, le test de manipulation par microneedles révèle que la perturbation du couplage entre le noyau et le cytosquelette entraîne des défauts dans la transmission des forces intracellulaires. Le principal avantage de ces techniques par rapport aux méthodes existantes, telles que l'aspiration par micropipette de noyaux isolés, réside dans leur capacité à mesurer la mécanique nucléaire au sein de cellules vivantes intactes, sans perturber l'architecture cellulaire normale. Ces méthodes peuvent fournir des informations sur la manière dont les modifications de la composition de l'enveloppe nucléaire influencent les propriétés mécaniques du noyau.

Ils peuvent également être utilisés pour étudier le rôle de la mécanique nucléaire dans des pathologies telles que les neuropathies liées à LA ou le cancer. Chaque boîtier d'étirement est constitué d'un plat en plastique sans fond, fabriqué sur mesure, d'un diamètre de trois pouces, et d'un anneau en plastique en forme de O permettant de maintenir une membrane en silicone, qui sert de substrat pour la culture cellulaire. Pour préparer le boîtier d'étirement, fixez une pièce carrée de membrane en silicone de quatre pouces sur quatre pouces entre l'anneau en O et le plat, découpez soigneusement l'excédent de membrane, rincez le boîtier d'étirement avec de l'eau déionisée, puis stérilisez-le à l'autoclave avant de recouvrir la membrane en silicone de molécules de matrice extracellulaire ; marquez un point de repère à l'extérieur de la membrane, au centre du fond.

Ce repère permettra d'identifier les mêmes cellules durant les expériences de contrainte pour l'application d'une déformation uniaxiale. Deux bandes parallèles de ruban adhésif sont appliquées autour du point de référence afin de limiter la formation de la membrane dans une dimension. Pour favoriser une adhésion optimale des cellules, recouvrir les membranes en silicone avec trois microgrammes par millilitre de fibronectine ou toute autre protéine de la matrice extracellulaire appropriée.

Couvrez la boîte de culture avec une boîte en polystyrène de 10 centimètres placée à l’envers et incubez-la toute la nuit à quatre degrés Celsius le jour suivant. Rincez la membrane une fois avec du PBS pour éliminer les protéines en excès. Remplissez la boîte avec 10 millilitres de milieu de croissance et mettez-la de côté.

Une fois que la boîte avec membrane de silicone revêtue a été préparée, les cellules sont détachées à l’aide de trypsine à 0,05 % et les cellules adhérentes sont ensemencées dans la boîte en milieu de croissance. Cette procédure est démontrée avec des embryons de souris.

Incubez les cellules pendant 24 à 48 heures dans des conditions de culture normales. Un microscope inversé équipé pour des expériences de contrainte du substrat comprend un dispositif de contrainte constitué d'une plaque de base qui se fixe sur la platine du microscope. La plaque maintient un plateau cylindrique central, qui sert à appliquer une contrainte sur la section centrale de la membrane en silicone.

L'appareil dispose également d'une plaque mobile qui maintient la boîte de culture soumise à contrainte et peut coulisser vers le haut et vers le bas sur quatre broches de guidage, ainsi que d'un poids de cinq livres pour appliquer une charge. Afin de visualiser les noyaux, incubez les cellules dans la boîte de culture soumise à contrainte avec un microgramme par millilitre de colorant Hoechst pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius. Après l'incubation, aspirez le milieu et remplacez-le par 15 millilitres de milieu de croissance sans rouge de phénol contenant 25 millimolaire de HEPES.

Ensuite, vissez le plat dans le support de plat et appliquez soigneusement de la graisse sur le pourtour de la partie inférieure de la membrane en silicone afin d'assurer un glissement de la membrane le long du platine central. Veillez à laisser la section centrale de la membrane dégagée. Placez la plaque de base sur la platine du microscope et fixez délicatement le support de plat sur la plaque de base.

Veillez à ce que, en position de repos initiale, la membrane en silicone de la boîte de contrainte repose mollement sur le plateau central. Ensuite, focalisez-vous sur la face inférieure de la membrane en silicone et repérez le point de référence noir central. Ce point servira de point de départ pour toutes les acquisitions d'images et permettra de localiser les mêmes cellules pendant et après l'étirement.

Dans cette image, le point central remplit tout le champ de vision. À partir de la bordure du point, ajustez la mise au point pour visualiser les cellules et le sommet de la membrane en silicone. Repérez des cellules bien étalées possédant des noyaux situés au centre.

Acquérir une image de contraste de face, qui doit se concentrer sur le contour des cellules et sur la membrane en silicone. Ensuite, acquérir une image de fluorescence de la coloration par le marqueur nucléaire nu, qui doit se concentrer sur le plan central du noyau. Après avoir acquis des images de cinq à quinze cellules, revenir au point central.

Appliquez lentement le poids sur la coupelle de contrainte afin d'obtenir une application uniforme de la contrainte. Au centre de la coupelle. La contrainte maximale appliquée au substrat est limitée par des entretoises en nylon placées sur les broches d'alignement verticales après l'application de la contrainte, focalisez-vous sur le fond de la membrane en silicone et localisez à nouveau le point de référence, en partant du point.

Déplacez les mêmes cellules et acquérez à nouveau une image en contraste de phase et en fin de fluorescence de chaque cellule dans le noyau sous contrainte maximale, en essayant de correspondre au plus près aux plans focaux des images initiales. Ce processus ne doit pas dépasser 10 minutes afin d'éviter le remodelage actif et l'adaptation de la cellule au substrat inhabituel. Une fois toutes les images correspondantes acquises, ramenez la platine du microscope au point de départ.

Retirez soigneusement le poids du plateau du porte-culture et laissez la membrane en silicone se détendre si nécessaire. Relevez délicatement le plat de culture jusqu'à ce qu'il retrouve sa position initiale. Ensuite, acquérez les images en contraste de phase et en fluorescence.

Des images des cellules après la déformation, obtenues exactement comme décrites pour les images de déformation, ainsi que des images des cellules et des noyaux marqués de façon fluorescente avant, pendant et après l'application de la déformation, sont analysées afin de calculer la déformation nucléaire normalisée. Dans cette démonstration, un script MATLAB personnalisé est utilisé pour l'analyse, mais plusieurs autres options sont disponibles pour calculer manuellement la déformation appliquée au substrat en faisant correspondre les positions de trois à six points de contrôle situés sur la membrane entre les images correspondantes avant et après déformation complète. Le programme MATLAB calcule ensuite la déformation appliquée à la membrane en comparant les positions des points de contrôle homologues entre les images avant déformation et sous déformation maximale.

Les positions sont également comparées pour la déformation résiduelle entre les images pré-entraînement et celles post-déformation. Les points de contrôle sont utilisés simultanément pour l'inscription des paires d'images, ce qui permettra de détecter les cellules endommagées ou se détachant. Ensuite, sélectionnez manuellement les noyaux à l'aide d'un programme MATLAB distinct qui calcule la déformation nucléaire pour chaque noyau individuel.

Cela est réalisé en appariant la taille nucléaire entre les images fluorescentes pré- et post-déformation complètes correspondantes, ou en appariant des marqueurs intranucléaires afin de tenir compte des petites variations de la déformation appliquée à la membrane entre différentes expériences. Les résultats sont exprimés en déformation nucléaire normalisée. Celle-ci est définie comme le rapport entre la déformation nucléaire induite et la déformation appliquée à la membrane, calculée pour chaque noyau.

Les scripts MATLAB sont disponibles sur demande auprès du laboratoire Lambing. Comme dernière étape, chaque noyau est validé et les mesures provenant de cellules qui se détachent ou sont endommagées pendant l'application de la contrainte sont exclues. Des MEF ayant adhéré sur deux zones distinctes de la membrane en silicone ont été observés en microscopie à contraste de phase et en microscopie de fluorescence avant, pendant et après l'application d'une contrainte axiale uniaxiale de 20 % ; l'image présentée ici illustre un exemple d'expérience réussie, avec des noyaux valides provenant de cellules ayant survécu à l'application de la contrainte sans aucun dommage ni détachement.

En revanche, les cellules présentées ici se sont rétractées ou partiellement détachées pendant l'application de la contrainte et sont exclues de l'analyse. La cellule située à gauche présente des signes de dommages au cytosquelette et d'effondrement nucléaire, tandis que celle de droite se détache partiellement et se rétracte durant l'application de la contrainte. Cela peut indiquer une contrainte excessive.

Ici, une analyse de la déformation nucléaire normalisée dans un ensemble de différentes lignées cellulaires de cellules méthyliées de souris déficientes en Laminine AC est présentée ; les cellules expriment de façon ectopique soit un vecteur vide, soit une laminine A de type sauvage, par comparaison avec des myoblastes de souris témoins de la même portée. La perte d'expression des protéines de l'enveloppe nucléaire, la Laminine AC, entraîne une augmentation de la déformation nucléaire normalisée. Ceci indique une diminution de la rigidité nucléaire, qui peut être partiellement ou totalement restaurée par la réintroduction d'une Laminine A de type sauvage. Pour préparer l'expérience de manipulation par microneedle, incuber une boîte de culture cellulaire de 35 millimètres à fond en verre avec une faible concentration de fibronectine pendant deux heures à 37 degrés Celsius. Après l'incubation, laver la boîte deux fois avec du HBSS et ajouter deux millilitres de milieu de croissance dans la boîte.

Ensuite, les fibroblastes embryonnaires de souris sont traités à la trypsine avec de la trypsine 0,05 % et semés dans le milieu de croissance sur une plaque à fond en verre revêtu de fibronectine, en deux millilitres de milieu de croissance. Pour obtenir des cellules uniques, adhérentes, non confluentes, remettre les cellules dans l'incubateur pendant la nuit afin de les colorer, puis ajouter au milieu de croissance le colorant mitochondrial MIT tracker et un colorant marquant le noyau. Ajouter ce milieu de croissance aux cellules, puis procéder à l'incubation.

Ensuite, lavez les cellules en les incubant dans une solution saline tamponnée au Hank pendant cinq minutes à température ambiante. Puis ajoutez le milieu de croissance sans rouge de phénol contenant 25 millimolaire de HEPES aux cellules pour l'imagerie.

Pour l'expérience avec l'aiguille micrométrique, insérez une aiguille micrométrique préalablement étirée dans un micromanipulateur couplé à un microscope inversé équipé d'un dispositif numérique à couplage de charge. Placez la caméra et focalisez l'aiguille micrométrique près d'une cellule unique. Acquérez une image de la cellule unique sans que l'aiguille micrométrique ne soit insérée dans le cytosquelette.

En contraste de phase, une image fluorescente des crochets 3 3, 3 4 2 et une image fluorescente de la coloration mitochondriale avec un objectif 60 x sur un microscope inversé en utilisant le micromanipulateur, insérez soigneusement l'aiguille micrométrique dans le cytoplasme d'une cellule à une distance fixe de la périphérie nucléaire, puis prenez une image en contraste de phase, une image fluorescente des crochets 3 3, 3 4, 2 et une image fluorescente de la coloration mitochondriale. Déplacez l'aiguille micrométrique d'une distance précise vers la périphérie cellulaire à une vitesse d'un micromètre par seconde, à l'aide du micromanipulateur contrôlé par ordinateur, tout en acquérant automatiquement des images toutes les 10 secondes.

Lorsque l'aiguille microscopique se déplace à une distance précise vers la périphérie de la cellule, le micro-manipulateur doit être contrôlé par ordinateur afin d'assurer une micro-manipulation constante. Les procédures permettent finalement d'acquérir des images après le retrait de l'aiguille microscopique ; les images du cytosquelette, ainsi que les caractéristiques fluorescentes marquées du noyau et du cytosquelette, acquises avant, pendant et après la manipulation par l'aiguille microscopique, sont analysées pour calculer le déplacement de petites régions intracellulaires. Dans cette démonstration, un script MATLAB personnalisé est utilisé pour l'analyse, mais plusieurs autres options sont disponibles.

Le script MATLAB est disponible sur demande auprès du laboratoire Lambing pour mesurer le déplacement généré par l'aiguille microscopique. Le programme MATLAB utilise un algorithme de corrélation croisée normalisée pour calculer le décalage entre la position d'origine des éléments marqués de manière fluorescente et leur position nouvellement identifiée. Les déplacements sont ensuite affichés sous forme de cartes vectorielles et stockés en tant que valeurs numériques.

L'étape suivante consiste à utiliser les cartes de vecteurs de déplacement obtenues pour déterminer les déplacements moyens au sein du cytosquelette ou du noyau à l'aide de matlab. Commencez par sélectionner trois points ou plus à l'intérieur du cytosquelette, situés au site d'application de la contrainte. Sur la carte des vecteurs de déplacement, calculez la valeur numérique moyenne afin de déterminer l'importance de la déformation du cytosquelette près du site d'application, générée lors de l'utilisation de l'aiguille micrométrique.

Ensuite, sélectionnez trois points ou plus à l'intérieur du noyau près du site d'application de la contrainte et prenez la valeur moyenne. Cette valeur représente la quantité de déformation nucléaire près du site d'application de l'aiguille micrométrique. En utilisant la même méthode, déterminez la déformation nucléaire et cytosquelettique éloignée du site d'application de la contrainte à partir de points sélectionnés dans ces régions respectives.

Un essai de manipulation par microneedle a été réalisé afin de mesurer la transmission des forces intracellulaires. On observe ici des images en contraste de phase et des images de fluorescence d'un fibroblaste marqué avec une coloration nucléaire bleue et une coloration mitochondriale verte au traceur MIT. Un microneedle a été inséré dans le cytosquelette à une distance définie du noyau, puis déplacé vers la périphérie de la cellule.

Le déplacement mitochondrial s'étend avant, pendant et après la contrainte du cytosquelette, puis les déplacements ont été représentés sous forme de vecteurs. Chaque vecteur représente le déplacement calculé comme le décalage entre la position d'origine et la nouvelle position identifiée. Les régions présentant une faible intensité d'image ou une texture insuffisante ont été exclues de l'analyse.

Les déplacements du cytosquelette et du noyau ont ensuite été quantifiés dans des zones sélectionnées à des distances croissantes du site d'application de la contrainte, tant pour les fibroblastes contrôles que pour les fibroblastes. Lorsque le couplage nucléocytoplasmique est intact, les forces sont transmises à travers l'ensemble de la cellule, entraînant une déformation induite du noyau et du cytosquelette qui s'atténue progressivement à mesure qu'on s'éloigne du site d'application de la contrainte. En revanche, les cellules présentant un couplage nucléocytoplasmique perturbé affichent un déplacement localisé près du site d'application et une déformation induite très faible à distance.

Une application comparable de contrainte cytosquelettique au site d'insertion de l'aiguille micrométrique est observée chez les fibroblastes témoins et chez les fibroblastes présentant un couplage nucléocytoplasmique perturbé. Toutefois, les déplacements nucléaire et cytosquelettique induits dans d'autres régions étaient significativement plus faibles dans les fibroblastes avec un couplage nucléocytoplasmique perturbé que dans les cellules témoins. Ainsi, une diminution du déplacement cytosquelettique et nucléaire à distance du site d'application de la contrainte indique que la transmission mécanique entre le cytosquelette et le noyau a été altérée.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment mesurer la mécanique nucléaire et la transmission des forces intracellulaires entre le noyau et le cytosquelette. Vous pouvez utiliser ces techniques pour étudier l'effet de mutations dans les protéines de l'enveloppe nucléaire ou les modifications de la composition de l'enveloppe nucléaire survenues au cours du développement ou dans le cancer.