Un test in vitro pour évaluer l’effet des anticorps sur le biofilm de Candida tropicalis

Prenez une microplaque contenant le champignon Candida tropicalis.

Les cellules sécrètent Sap2, une enzyme protéolytique qui clive une glycoprotéine transmembranaire appelée Msb2, supprimant son domaine inhibiteur.

Cela induit le champignon à adhérer au fond et à se développer en une microcolonie de levures et de formes filamenteuses. Les cellules sécrètent des composants solubles et des biopolymères, initiant la formation de biofilms.

Ajoutez un échantillon de sérum contenant des anticorps spécifiques de Sap2 dans des puits sélectionnés et incubez dans l’obscurité.

Les anticorps se lient à Sap2 et neutralisent son activité, entravant la viabilité cellulaire et la maturation du biofilm.

Dans les puits non traités, le biofilm se transforme en un réseau dense de cellules et de matrice extracellulaire.

Aspirez le liquide, lavez le biofilm et faites sécher la plaque à l’air. Ajoutez un substrat chromogène et incubez dans l’obscurité.

Des cellules viables, utilisant des oxydoréductases liées à la membrane, réduisent le substrat en un produit coloré.

Transférez le surnageant coloré et lisez l’absorbance.

Une absorbance plus faible dans les puits traités au sérum indique une inhibition du biofilm médiée par les anticorps.

Préparez des dilutions en série d’échantillons de sérum inactivés par la chaleur dans un milieu stérile RPMI1640 MOPS. Ajoutez 100 microlitres de la dilution sérique sélectionnée dans chaque puits de la plaque de microtitration à 96 puits.

Dans la colonne 10, ajouter seulement le milieu RPMI1640-MOPS pour le témoin positif fongique seulement. Ajouter une dilution de 1 à 50 du sérum dans tous les puits de la colonne 11 pour servir de témoin négatif sérique sans champignon plus. Après avoir recouvert l’assiette d’un couvercle et d’une feuille d’aluminium, incubez l’assiette pendant 24 heures à 37 degrés Celsius.

Le lendemain, après avoir aspiré soigneusement le sérum à l’aide d’une pipette multicanaux, tapotez doucement la plaque inversée pour éliminer tout résidu de sérum. Répétez le lavage PBS trois fois et faites sécher la plaque à l’air libre pendant 30 minutes à température ambiante à l’intérieur d’une enceinte de sécurité biologique pour sécher tout excès de PBS.

Ensuite, dissolvez 25 milligrammes de XTT dans 50 millilitres de lactate de Ringer stérilisé par filtre. Aliquote 10 millilitres dans des tubes séparés. Couvrez-le de papier d’aluminium et conservez-le à moins 80 degrés Celsius. Ensuite, dissolvez 8,6 milligrammes de ménadione dans 5 millilitres d’acétone, et après avoir distribué 50 microlitres dans 100 microtubes séparés, stockez les aliquotes à moins 80 degrés Celsius.

Prenez 10 millilitres de XTT et ajoutez 1 microlitre de ménadione pour obtenir une solution de travail de 1 micromolaire. Ajouter 100 microlitres de la solution de ménadione XTT par puits de la plaque de microtitration à 96 puits. Ensuite, après avoir recouvert l’assiette d’un couvercle et d’une feuille d’aluminium, incubez l’assiette pendant deux heures à 37 degrés Celsius dans l’obscurité. Enfin, transférez 80 microlitres du surnageant coloré de chaque puits dans une plaque fraîche de 96 puits et lisez la plaque à 490 nanomètres.