Une technique d’immunofluorescence à double marquage pour visualiser les protéines de l’hôte et de l’agent pathogène dans une cellule infectée

Commencer avec des cellules épithéliales fixes et perméabilisées infectées par un parasite pathogène.

Ajoutez un tampon de blocage pour empêcher la liaison d’anticorps non spécifiques.

Superposition avec des anticorps primaires polyclonaux de souris, interagissant spécifiquement avec les protéines du parasite.

Ajoutez des anticorps secondaires marqués au fluorophore rouge lointain qui interagissent avec les anticorps primaires liés aux protéines parasites.

Laver pour éliminer les anticorps non liés. Bloquez avec des anticorps anti-souris qui se lient aux anticorps primaires, minimisant ainsi la réactivité croisée lors du marquage hôte-protéine.

Ajouter des anticorps primaires monoclonaux de souris ciblant les ribonucléoprotéines de l’hôte dans les cellules épithéliales.

Superposer avec un mélange d’anticorps secondaires marqués au fluorophore vert et de phalloïdine conjuguée au fluorophore rouge, facilitant le marquage des anticorps primaires liés aux protéines de l’hôte et de l’actine, respectivement.

Laver avec un tampon. Montage à l’aide d’un milieu contenant une coloration d’ADN, conférant une coloration bleue au noyau de l’hôte, au noyau du parasite et au kinétoplaste.

Analysez les échantillons à l’aide d’un microscope confocal. La technique d’immunofluorescence à double marquage montre des protéines hôtes vertes et des protéines parasites rouges, permettant leur localisation subcellulaire précise.

Ajoutez des cellules LLC-MK2 dans des plaques de 24 puits contenant des lamelles arrondies stérilisées aux UV et laissez-les se stabiliser pendant 16 heures. Ensuite, pour infecter les cellules, ajoutez du surnageant contenant T. cruzi dans chaque puits et incubez pendant six heures. Ensuite, lavez 5 fois les lamelles contenant les cellules infectées et non infectées avec du PBS.

Ensuite, fixez les cellules avec 2 % de paraformaldéhyde et de PBS. Après 10 minutes, lavez les lamelles trois fois pendant 5 minutes chacune avec du PBS, puis perméabilisez les lamelles avec un détergent non ionique pendant 10 minutes.

Après trois lavages PBS de 5 minutes, incuber les lamelles dans une solution bloquante pendant 30 minutes, suivies d’une autre incubation de 30 minutes avec un anticorps monoclonal ou polyclonal de souris. Après les lavages, incubez les lamelles pendant 30 minutes avec un anticorps secondaire dans une solution bloquante et de la phalloïdine pour colorer les filaments d’actine dans la cellule hôte.

Ensuite, lavez à nouveau les lamelles avec du PBS avant d’appliquer une petite quantité de réactif de montage anti-décoloration avec un milieu DAPI sur la surface de la lame. À l’aide d’une pince, inclinez doucement la lamelle dans le milieu pour éviter la formation de bulles.

Pour le double marquage, après avoir incubé les lamelles et la solution de blocage comme démontré précédemment, incubez-les dans l’anticorps polyclonal de souris pendant 30 minutes. Ensuite, lavez les lamelles trois fois pendant 5 minutes chacune avec du PBS avant de les incuber avec l’anticorps secondaire pendant 30 minutes.

Ensuite, après trois lavages PBS, effectuez une deuxième étape de blocage avec des IgG anti-souris de lapin AffiniPure dilués dans une solution de blocage. Après 30 minutes, lavez à nouveau les lamelles avec du PBS avant de les incuber avec l’anticorps monoclonal de souris pendant 30 minutes supplémentaires.

Ensuite, après trois lavages PBS, incubez les lamelles avec un anticorps IgG2b anti-souris de chèvre et de la phalloïdine. Ensuite, après trois lavages PBS, appliquez le réactif de montage anti-décoloration comme démontré précédemment.