Une technique de coloration par immunofluorescence pour détecter la neurogenèse de l’hippocampe adulte

Prenez une section de cerveau murin composée du gyrus denté de l’hippocampe, un site de neurogenèse composé de progéniteurs neuronaux à des stades de différenciation distincts.

Transférez la section dans une solution de blocage de la perméabilisation. Les molécules détergentes de la solution pénètrent les cellules, tandis que les protéines bloquent les sites de liaison non spécifiques.

Ajoutez un cocktail d’anticorps primaires ciblant des marqueurs de neurogenèse spécifiques, une protéine associée aux microtubules et une protéine de filament intermédiaire.

Retirez les anticorps non liés. Introduire différents anticorps secondaires marqués au fluorophore qui se lient aux anticorps primaires.

Ajoutez des protéines sériques du même hôte que l’un des anticorps primaires, en saturant les paratopes des anticorps secondaires.

Introduire des fragments Fab monovalents qui saturent les épitopes des protéines sériques, empêchant ainsi la liaison non spécifique.

Ajoutez un deuxième anticorps primaire élevé par le même hôte, en se liant à une autre protéine de filament intermédiaire.

Introduire des anticorps secondaires marqués au fluorophore ciblant le deuxième anticorps primaire.

À l’aide de la microscopie à fluorescence, identifiez les sous-types de progéniteurs neuronaux exprimant des combinaisons de marqueurs uniques.

Commencez par transférer les sections de la solution d’antigel au TBS à l’aide d’une brosse fine. Rincez abondamment les sections, en commençant par un lavage de nuit à 4 degrés Celsius, suivi de cinq lavages de 10 minutes à température ambiante. Toutes ces incubations doivent être effectuées avec une agitation douce et continue.

Si l’un des antigènes d’intérêt est un analogue de la thymidine, une étape de dénaturation de l’acide chlorhydrique doit être mise en œuvre à ce stade, suivie d’une étape de neutralisation dans un tampon de borate. Procéder à la perméabilisation et au blocage des sites de liaison aux anticorps non spécifiques dans TBS-plus. Laissez cette incubation pendant 1 heure à température ambiante.

Ensuite, incubez le premier anticorps primaire dilué dans TBS-plus pendant la nuit à 4 degrés Celsius. Le lendemain, lavez les sections trois fois dans TBS et une fois dans TBS-T. Laissez aller chaque bain pendant 10 minutes. Ensuite, incubez le premier anticorps secondaire conjugué au fluorochrome pendant trois heures à température ambiante. À partir de maintenant, protégez les sections de l’exposition à la lumière.

Après une autre série de lavages, transférez les sections dans une solution sérique à 10 % de l’espèce hôte à partir de laquelle les deux anticorps primaires ont été fabriqués. Incuber les sections dans cette solution pendant trois heures pour saturer les paratopes ouverts sur le premier anticorps secondaire. Plus tard, rincez trois fois au TBS et une fois au TBS-T pour éliminer le sérum.

Ensuite, préparez une solution de TBS-plus avec 50 microgrammes par millilitre de fragments Fab monovalents non conjugués dirigés contre l’espèce hôte de l’anticorps primaire. Cela couvre les épitopes qui pourraient autrement être reconnus par le deuxième anticorps secondaire. Transférez les sections dans cette solution et incubez toute la nuit à 4 degrés Celsius.

Après l’incubation, rincer les sections au moins trois fois dans le TBS et une fois dans le TBS-T. Lors des transferts, tamponnez les inserts en maille contenant les sections sur une serviette en papier pour éliminer les résidus de Fab. Maintenant, incubez les sections du deuxième anticorps primaire pendant la nuit à 4 degrés Celsius.

Après une autre série de lavages, appliquez le deuxième anticorps secondaire pendant trois heures à température ambiante. Enfin, lavez les sections trois fois dans du TBS et procédez au montage des sections dans de la gélatine. Faites sécher les lames à l’air libre et couvre-elles à l’aide d’un support de montage anti-décoloration.