Une technique d’immunomarquage pour visualiser la localisation subcellulaire des protéines

Commencez par laver une section de cœur fixe dans un tampon de cacodylate de sodium qui stabilise la structure tissulaire. Immergez la section dans du tétraoxyde d’osmium pour colorer les lipides de la membrane.

Traiter avec de l’acétate de sodium pour maintenir un pH optimal pour la coloration.

Ajoutez de l’acétate d’uranyle pour colorer les biomolécules, offrant un meilleur contraste pendant la microscopie.

Déshydratez les tissus à des concentrations croissantes d’éthanol suivi d’acétone.

Incorporez le tissu dans une résine, obtenez des coupes ultrafines et transférez-les sur une grille de microscopie.

Introduisez du méta-periodate de sodium pour éliminer le tétraoxyde d’osmium, démasquant ainsi la protéine cellulaire.

Le composé oxyde également la glycoprotéine, créant des groupes aldéhydes réactifs, qui sont neutralisés par le traitement à la glycine.

Introduire un tampon de blocage, empêchant la liaison d’anticorps non spécifiques.

Ajouter des anticorps primaires spécifiques à la protéine cible, suivis d’anticorps secondaires biotinylés.

Ajoutez des points quantiques conjugués à la streptavidine qui se lient à la biotine.

Au microscope électronique, les régions marquées par des points quantiques présentent un contraste plus élevé, ce qui permet une localisation subcellulaire précise de la protéine cible.

Après 24 heures de fixation, lavez le tissu dans un tampon de cacodylate de sodium de 0,1 molaire deux fois pendant 20 minutes. Retirer le tissu du tampon de cacodylate de sodium et l’immerger dans une solution de tétroxyde d’osmium à 2 % pendant 4 heures à température ambiante.

Après l’osmication, plongez le tissu dans une solution d’acétate de sodium à 2 % pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, plongez le tissu dans une solution d’acétate d’uranyle à 2 % pendant 1 heure à température ambiante. Après la coloration à l’acétate d’uranyle, déshydratez le tissu séquentiellement à travers les alcools gradués et l’acétone.

Intégrez le tissu déshydraté dans de la résine époxy à faible viscosité comme décrit dans le manuscrit. Mettez le tissu dans de la résine fraîche dans des micro-moules de 8 millimètres, des moules, et durcissez le tissu incrusté à 70 degrés Celsius pendant la nuit. Après avoir trouvé la zone d’intérêt à l’aide d’un couteau à ultra 45 degrés, produisez des sections ultra-minces en or pâle. Placez ces sections ultra-minces sur le côté terne d’une grille de cuivre de 200 mailles.

Commencez la coloration en démasquant l’antigène en mettant 20 microlitres de métaperiodate de sodium en solution de gravure sur un film de paraffine propre. Placez la grille séchée avec des sections de tissu sur la gouttelette de la solution de gravure. Laissez la grille de section sur la solution pendant 30 minutes à température ambiante. Lavez les sections de tissu gravées en les plaçant sur une gouttelette d’eau distillée pendant 60 secondes.

Bloquez les aldéhydes résiduels en plaçant la grille de section sur une gouttelette de solution de glycine à 0,05 molaire pendant 10 minutes à température ambiante. Épongez les bords de la grille sur du papier filtre pour éliminer la solution résiduelle de glycine. Placez la grille de section dans 10 à 20 microlitres de solution de blocage pendant 25 minutes à température ambiante.

Épongez les bords de la grille sur du papier filtre et placez les sections de la grille sur un diluant d’anticorps pour le conditionnement à température ambiante pendant 10 minutes. Incuber les sections de la grille avec l’anticorps primaire pendant 1 heure 30 minutes dans une chambre humidifiée. Séchez la grille et lavez les sections de la grille avec un diluant d’anticorps deux fois pendant 5 minutes chacune.

Incuber les sections de la grille avec un anticorps secondaire biotinylé pendant 1 heure dans une chambre humidifiée. Une fois que la grille est séchée par transfert, lavez-la deux fois avec un diluant d’anticorps pendant 5 minutes chacune. Incuber les sections de grille dans du QD conjugué à la streptavidine disponible dans le commerce pendant 1 heure dans une chambre humidifiée à température ambiante. Évitez l’exposition à la lumière en recouvrant la chambre d’une feuille d’aluminium. Après avoir séché les bords de la grille à l’aide de papier filtre, lavez les sections de la grille en les plaçant sur des gouttelettes d’eau pendant deux minutes et épongez les bords de la grille pour les faire sécher.