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Immunologie
0 vues • 4:09 min • July 8th, 2025
Prenez la cryosection d’une biopsie cutanée d’un patient atteint de la maladie de Parkinson enfermée dans un milieu d’enrobage.
Le tissu comprend un épiderme le plus externe, un derme sous-jacent et de la graisse sous-cutanée innervée par les nerfs.
Lavez la section pour retirer le support d’enrobage. Transférez-le dans une solution de blocage de la perméabilisation, perméabilisant les cellules et bloquant les sites de liaison non spécifiques.
Immergez la section dans un cocktail d’anticorps primaires pour obtenir un marquage uniforme des anticorps, appelé coloration flottante.
Les anticorps pénètrent dans les neurones et se lient aux agrégats d’alpha-synucléine répartis le long des axones – une forme agrégée caractéristique des maladies neurodégénératives – et aux hydrolases carboxyl-terminales.
Introduire des anticorps secondaires conjugués aux fluorophores qui se lient aux anticorps primaires.
Traitez avec un colorant fluorescent qui tache le noyau.
Placez le mouchoir sur une lame, appliquez un support de montage et scellez-le avec une lamelle.
Au microscope confocal, la fluorescence des deux anticorps révèle la présence d’agrégats d’alpha-synucléine le long des axones des neurones dermiques.
Pour commencer, remplissez certains des puits d’une plaque fraîche de 96 puits avec 100 microlitres de solution de lavage. Transférez les sections à analyser de la plaque de stockage à celle contenant la solution de lavage. Laissez les sections dans la solution de lavage pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, transférez chaque section dans un puits vide contenant la même solution de lavage et répétez le lavage. Ensuite, ajoutez une solution de lavage aux sections et transférez-les dans de nouveaux puits contenant 100 microlitres de solution de blocage. Incuber à température ambiante pendant au moins 90 minutes et au maximum 4 heures.
Diluez les anticorps primaires, anti-PGP9.5 et anti-5G4 dans la solution de travail. Transférez les sections dans de nouveaux puits contenant 100 microlitres de la solution de travail des anticorps primaires et incubez pendant la nuit à température ambiante.
Le lendemain, lavez les sections dans des puits contenant la solution de lavage décrite précédemment. Diluez les anticorps secondaires - chèvre anti-lapin pour détecter l’anti-PGP9.5 et chèvre anti-souris pour détecter 5G4 dans la solution de travail.
Transférez les sections lavées dans de nouveaux puits contenant 100 microlitres de la solution de travail des anticorps secondaires. Recouvrez la plaque d’une feuille d’aluminium pour éviter le blanchiment du fluorophore conjugué aux anticorps secondaires, et incubez à température ambiante pendant 90 minutes.
Après cela, lavez les sections deux fois dans une solution de lavage comme décrit précédemment. Transférez les sections lavées dans de nouveaux puits contenant 100 microlitres de DAPI pendant 5 minutes à température ambiante. Lavez les sections deux fois dans une solution de lavage comme décrit précédemment. Ensuite, montez les sections sur une glissière dans la bonne position, en évitant les erreurs de pliage.
Ajoutez quelques gouttes de support de montage sur la glissière et couvrez la section avec une lamelle. Laissez sécher les lames pendant la nuit. Le lendemain, rangez les lames dans une boîte appropriée à 4 degrés Celsius, en veillant à éviter l’exposition à la lumière.
À l’aide d’un microscope à fluorescence inversée ou d’un microscope confocal, visualisez les coupes. Acquérez les images à l’aide d’une caméra connectée au microscope. Ensuite, utilisez un microscope à fluorescence ou un microscope confocal pour analyser les signaux positifs en sections, en termes de distribution spatiale et d’intensité du signal, comme indiqué dans le protocole de texte.