Immunolocalisation des protéines d’arabinogalactane et des pectines dans les tissus végétaux

Prenez une lame avec des puits de réaction contenant de fines sections de différents tissus végétaux. Les tissus sont fixés et intégrés dans une résine pour l’immunomarquage.

Placez la lame à l’intérieur d’une chambre d’incubation sombre et humide pour éviter l’exposition à la lumière et l’évaporation du réactif au cours des étapes suivantes.

Introduire une solution de blocage pour éviter l’interaction d’anticorps non spécifiques.

Lavez pour éliminer l’excès de solution bloquante, puis ajoutez des anticorps primaires spécifiques de l’antigène et incuberez.

Les anticorps se lient à leurs antigènes cibles, à savoir les protéines arabinogalactanes et les pectines dans la paroi cellulaire.

Introduire des anticorps secondaires conjugués aux fluorophores, qui se lient aux anticorps primaires.

Lavez pour éliminer les anticorps non liés et appliquez un colorant fluorescent qui se lie à la cellulose, marquant la paroi cellulaire.

Ajoutez un support de montage et scellez-le à l’aide d’une lamelle.

Au microscope, la fluorescence du colorant et les anticorps liés aident à visualiser la cellulose dans les parois cellulaires végétales colocalisée avec des protéines d’arabinogalactane ou de la pectine, montrant leur distribution spécifique aux tissus.

Pour préparer une chambre d’incubation pour les lames de réaction, placez des serviettes en papier humides au fond d’une boîte d’embouts de pipette et enveloppez la boîte avec du papier d’aluminium. Transférez les lames de la boîte dans la chambre d’incubation. Pipette 50 microlitres de solution de blocage dans chaque puits. Après avoir incubé la lame pendant 10 minutes, retirez la solution de blocage. Ensuite, lavez tous les puits deux fois avec du PBS pendant 10 minutes à chaque fois. Après avoir préparé les solutions d’anticorps primaires comme décrit dans le manuscrit, effectuez un lavage final des puits avec de l’eau distillée et désionisée pendant 5 minutes.

Pipeter la solution d’anticorps primaire dans les puits de réaction. Ensuite, pipetez la solution de blocage dans les puits de contrôle. Fermez la chambre d’incubation. Laissez-le reposer pendant deux heures à température ambiante, puis réfrigérez-le toute la nuit à 4 degrés Celsius. Préparez une solution à 1 % de l’anticorps secondaire dans une solution bloquante. Environ 40 microlitres par puits seront nécessaires.

Couvrir la solution de papier d’aluminium. Lavez les puits de la lame de réaction deux fois avec du PBS et une fois avec de l’eau distillée et désionisée pendant 10 minutes à chaque fois. Assurez-vous qu’il ne reste pas de solution de blocage ou de dépôts dans les puits. Pipetez la solution secondaire d’anticorps dans tous les puits. Incuber les lames dans l’obscurité à température ambiante pendant 3 à 4 heures.

Encore une fois, lavez les puits de la lame de réaction deux fois avec du PBS et une fois avec de l’eau distillée et désionisée. Ajoutez ensuite une goutte de blanc de calcofluor dans chaque puits. Sans laver, ajoutez une goutte de support de montage dans chaque puits et couvrez chaque puits avec une lamelle. Observez les sections d’échantillon dans la lame de réaction à l’aide d’un microscope à fluorescence.

Pour chaque observation, utilisez un filtre UV pour détecter les parois cellulaires colorées par le calcofluor et un filtre FITC pour détecter l’immunolocalisation. Pour une meilleure visualisation des résultats, utilisez ImageJ ou un programme d’analyse d’images similaire pour fusionner chaque image de filtre UV avec l’image de filtre FITC correspondante.