Utilisation d’un ELISA sandwich pour déterminer la teneur en glycoprotéines immunogènes d’un vaccin

Commencer avec une plaque de test passivée recouverte d’anticorps monoclonaux spécifiques de la glycoprotéine immunogène de la rage et d’un agent bloquant pour prévenir les interactions non spécifiques.

Introduire des vaccins antirabiques de référence et d’essai dilués en série avec une teneur en glycoprotéines décroissante. Scellez la plaque pour éviter toute contamination.

Au cours de l’incubation, les glycoprotéines immunogènes interagissent avec les anticorps monoclonaux enrobés via un site antigénique spécifique.

Après l’incubation, retirez le film, aspirez le surnageant et lavez la plaque.

Superposition d’anticorps monoclonaux spécifiques de la glycoprotéine conjugués à des enzymes qui se lient à un site antigénique différent sur la glycoprotéine, formant un immunocomplexe.

Ajouter une solution contenant un substrat et un chromogène. Lorsque le substrat interagit avec l’enzyme, il provoque l’oxydation du chromogène, modifiant la couleur de la solution.

Ajouter une solution d’arrêt pour inactiver les enzymes.

Mesurer l’absorbance et générer une courbe de référence à l’aide des valeurs de référence du vaccin.

Identifier la région où il existe une relation linéaire entre l’absorbance et la teneur en glycoprotéines des dilutions du vaccin de référence. Ensuite, extrapolez la teneur en glycoprotéines des dilutions du vaccin d’essai en fonction de l’absorbance qui se trouve dans cette région.

Pour laver la lame, ajoutez 300 microlitres de tampon de lavage dans chaque puits. Ensuite, aspirez soigneusement et transférez le contenu du puits dans un récipient contenant une solution d’hypochlorite de sodium à 2,6 %. Répétez ce processus de lavage cinq fois de plus pour laver abondamment la plaque sensibilisée.

Après cela, retournez la microplaque et laissez-la sécher sur un morceau de papier absorbant à température ambiante pendant une minute. Reconstituer le vaccin de référence dans un millilitre d’eau distillée de sorte que la concentration finale de glycoprotéine du virus de la rage soit de 10 microgrammes par millilitre. Préparer une dilution 10 fois du vaccin de référence reconstitué dans le diluant pour atteindre une concentration en glycoprotéines du virus de la rage d’un microgramme par millilitre.

Ensuite, effectuez six dilutions en deux séries de ce vaccin de référence dans le diluant, comme indiqué dans le tableau un du protocole textuel. Répartir 200 microlitres de diluant dans des puits en double pour servir de témoin à blanc, et 200 microlitres par puits pour chaque dilution de vaccin de référence en double.

Ensuite, préparer une dilution en 10 fois du vaccin testé dans le diluant et préparer sept dilutions en série en deux fois du vaccin testé dans le diluant, comme indiqué dans le tableau deux du protocole textuel. Répartissez 200 microlitres de chaque dilution de vaccin testée en double exemplaire dans chaque puits de la microplaque. Recouvrez la microplaque d’un film adhésif et incubez à 37 degrés Celsius pendant une heure.

Après cela, retirez le film, aspirez soigneusement et transférez le contenu de chaque puits dans un récipient contenant une solution d’hypochlorite de sodium à 2,7 %. Pour laver la plaque, ajoutez 300 microlitres de tampon de lavage dans chaque puits. Aspirez avec précaution et transférez le contenu de chaque puits dans un récipient contenant une solution d’hypochlorite de sodium à 2,6 %.

Répétez le processus de lavage cinq fois de plus pour éliminer l’antigène non lié. et conservez les trimères de protéine G liés à l’anticorps enrobé. Retournez la microplaque lavée et laissez-la sécher sur un morceau de papier absorbant à température ambiante pendant une minute. Ensuite, distribuez 200 microlitres de la dilution recommandée de l’anticorps monoclonal D1 marqué à la peroxydase dans un diluant dans chaque puits.

Recouvrez la microplaque d’un film adhésif et incubez à 37 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, retirez le film, aspirez soigneusement et transférez le contenu de chaque puits dans un récipient contenant une solution d’hypochlorite de sodium à 2,6 %. Pour laver la microplaque, ajoutez 300 microlitres de tampon de lavage dans chaque puits.

Aspirez avec précaution et transférez le contenu de chaque puits dans un récipient contenant une solution d’hypochlorite de sodium à 2,6 %. Répétez ce processus de lavage cinq fois de plus pour éliminer l’anticorps non lié marqué à la peroxydase. Retournez la microplaque de lavage et laissez-la sécher sur un morceau de papier absorbant à température ambiante pendant une minute.

Ensuite, répartissez 200 microlitres de solution chromogène de substrat dans chaque puits. Scellez la microplaque avec un film et incubez à température ambiante dans l’obscurité pendant 30 minutes. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de solution d’arrêt dans chaque puits pour arrêter la réaction.

Essuyez soigneusement le bas de la microlame et placez-la dans un spectrophotomètre. Déterminer la densité optique à 492 nanomètres pour tous les puits utilisés. Collectez ces données dans un tableur à des fins d’analyse. Ensuite, créez des graphiques pour la courbe de référence du vaccin et les valeurs de densité optique, comme indiqué dans le protocole textuel.