Immunomarquage de cellules encapsulées dans un système d’hydrogel 3D

Prenez une plaque multi-puits contenant des cellules de mammifères encapsulées dans un système d’hydrogel imitant l’environnement naturel de la matrice extracellulaire.

Retirez le milieu de culture. Traiter avec un tampon de fixation pour réticuler les protéines, préservant ainsi l’intégrité cellulaire.

Ajouter une solution contenant un détergent pour perméabiliser la membrane cellulaire.

Introduisez une solution bloquante pour empêcher la liaison d’anticorps non spécifiques dans les étapes suivantes.

Ajoutez un cocktail d’anticorps primaires qui pénètre dans les cellules et se lie spécifiquement aux filaments intermédiaires cytoplasmiques et au facteur de transcription cible.

Retirez les anticorps non liés. Introduisez des anticorps secondaires marqués par fluorescence et une coloration nucléaire pour marquer l’ADN par fluorescence.

Retirez les molécules non liées.

Montez la culture d’hydrogel sur une lame à l’aide d’un support de montage.

Utilisez un microscope confocal pour observer les cellules immunomarquées.

Tout d’abord, aspirez le milieu de chaque puits. Ensuite, lavez les puits avec 1 millilitre de DPBS chaud. Une fois le lavage terminé, ajoutez 750 microlitres de solution de fixation dans chaque puits. Ensuite, incubez la plaque à 24 puits à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après l’incubation, aspirez la solution de fixation de chacun des puits et jetez le fixateur dans un conteneur à déchets dangereux. Ensuite, ajoutez 1 millilitre de DPBS à l’échantillon et jetez immédiatement le DPBS dans un contenant de déchets dangereux.

Ensuite, ajoutez 750 microlitres de solution de perméabilisation pour perméabiliser l’échantillon pendant une heure à température ambiante sur le rocker, à 15 tours par minute. Au bout d’une heure, aspirez la solution de perméabilisation et ajoutez 750 microlitres de solution de blocage à l’échantillon. Laissez l’échantillon sur la bascule à température ambiante pendant trois heures. Ensuite, diluez les anticorps primaires souhaités avec la solution de dilution d’anticorps.

Ensuite, ajoutez 500 microlitres de solution d’anticorps à chaque échantillon. Incuber les échantillons pendant la nuit à 4 degrés Celsius. Le lendemain, aspirez la solution d’anticorps primaire. Ensuite, lavez les échantillons avec du PBST pendant trois heures, à température ambiante, à 15 tours par minute.

Ensuite, diluez les anticorps secondaires appropriés et 5 mg/ml de solution mère de DAPI pour obtenir une concentration finale de 2,5 microgrammes par millilitre. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de la solution à chaque échantillon. Ensuite, utilisez du papier d’aluminium pour couvrir la plaque de 24 puits et incubez la plaque à 4 degrés Celsius pendant la nuit.

Le lendemain, aspirez la solution d’anticorps secondaire et lavez les échantillons avec du PBST trois fois, chacun pendant 30 minutes à température ambiante sur une bascule. Ensuite, placez une goutte de support de montage dur sur la surface d’une lame de verre et placez l’échantillon sur le support de montage. Enfin, utilisez du vernis à ongles pour sceller les échantillons sur la lame de couverture en verre afin d’éviter la contamination ou le mouvement de l’échantillon.