Une technique in vitro pour étudier le trafic des récepteurs du glutamate dans les neurones de l’hippocampe
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 vues • 5:27 min • July 8th, 2025
Prélever trois échantillons de cultures neuronales de l’hippocampe sur des lamelles.
Introduire des anticorps primaires pour marquer les récepteurs du glutamate exprimés en surface.
Ajouter un milieu conditionné aux deuxième et troisième échantillons pour induire l’endocytose des récepteurs liés aux anticorps.
Sur le troisième échantillon, ajoutez des fragments Fab pour bloquer les épitopes sur les anticorps non endocytosés.
Introduire un inhibiteur pour bloquer l’endocytose des récepteurs tout en permettant le recyclage des récepteurs à la surface.
Dans tous les échantillons, fixez les cellules et ajoutez une solution de blocage pour éviter l’étiquetage non spécifique.
Introduire des anticorps secondaires marqués au fluorophore pour marquer les anticorps primaires sur les récepteurs liés à la surface, y compris les récepteurs recyclés.
Perméabiliser les membranes cellulaires.
Ajoutez à nouveau l’anticorps primaire au premier échantillon pour marquer les récepteurs endocytosés préexistants.
Introduire un anticorps secondaire différent marqué au fluorophore dans tous les échantillons pour marquer les anticorps primaires liés au récepteur endocytosé, en distinguant les récepteurs endocytosés et les récepteurs liés à la surface.
À l’aide d’un microscope confocal, quantifiez les récepteurs exprimés en surface, endocytosés et recyclés dans les différents traitements.
Pour commencer cette procédure, transférez les lamelles côté cellule vers le haut dans un plateau recouvert d’un film de paraffine afin d’économiser les réactifs et de faciliter la manipulation. Conservez et maintenez les milieux conditionnés à 37 degrés Celsius pour les étapes d’incubation et de lavage.
Incuber les cellules avec des anticorps primaires dilués dans un milieu conditionné à température ambiante pendant 15 minutes. Après cela, à l’aide d’une pipette à vide, aspirez soigneusement les milieux contenant des anticorps et lavez les cellules trois fois avec des milieux conditionnés.
Si vous étudiez l’expression des récepteurs de surface par rapport à l’expression des récepteurs intracellulaires, fixez les cellules avec du paraformaldéhyde après cette étape, comme indiqué dans le protocole de texte. Maintenez les cellules dans un milieu conditionné sans anticorps et retournez-les dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pour permettre l’internalisation. Si vous étudiez le processus d’internalisation, fixez les cellules avec du paraformaldéhyde après cette étape, comme indiqué dans le protocole de texte.
Pour bloquer les épitopes de l’anticorps primaire attaché aux récepteurs exprimés en surface qui n’ont pas été internalisés, incubez des cellules avec des fragments d’anticorps Fab anti-IgG non conjugués dilués dans un milieu conditionné pendant 20 minutes à température ambiante. Après cela, lavez les cellules trois fois avec un milieu conditionné. Incuber les puits lavés avec des milieux conditionnés contenant 80 dynasores micromolaires à 37 degrés Celsius pour permettre le recyclage des récepteurs internalisés.
Après avoir terminé les modifications sur les cellules vivantes, lavez les cellules une fois avec PBS+. Ajoutez une solution de paraformaldéhyde à 4 % et de saccharose à 4 % dans du PBS aux cellules et incubez dans une hotte à température ambiante pendant 7 à 8 minutes pour fixer les cellules. Ensuite, lavez les cellules trois fois avec du PBS ordinaire. Ajoutez une solution de sérum de chèvre normal à 10 % dans du PBS dans les cellules et incubez à température ambiante pendant 30 minutes pour bloquer les sites de liaison non spécifiques.
Ensuite, incubez les cellules avec des anticorps secondaires marqués par fluorescence dilués dans 3 % de NGS dans du PBS à température ambiante pendant une heure pour marquer les récepteurs primaires marqués par des anticorps. Après cela, lavez les cellules trois fois avec du PBS.
Pour commencer à marquer les récepteurs intracellulaires, ajoutez une solution de Triton-X à 0,25 % dans du PBS et incubez à température ambiante pendant 5 à 10 minutes pour perméabiliser les cellules. Ensuite, bloquez avec 10 % NGS à température ambiante pendant 30 minutes. Si vous étudiez la surface par rapport à la totalité, incubez les cellules avec le même anticorps primaire utilisé précédemment, dilué dans 3 % NGS dans PBS à température ambiante pendant une heure pour marquer les récepteurs intracellulaires.
Ensuite, lavez les cellules trois fois avec du PBS. Marquage avec un deuxième anticorps secondaire marqué par fluorescence dilué dans 3 % de NGS dans du PBS à température ambiante pendant une heure. Après cela, lavez les cellules trois fois avec du PBS. Tout d’abord, placez délicatement les lamelles, côté cellule vers le bas, sur 12 à 15 microlitres du support de montage approprié pour monter les cellules. Ensuite, imagez les cellules sur le microscope confocal approprié et analysez les cellules comme indiqué dans le protocole de texte.
Aperçu
Cet article décrit un protocole permettant d'étudier la dynamique des récepteurs du glutamate dans des cultures neuronales de l'hippocampe. Il détaille les méthodes de marquage, de fixation et de quantification des récepteurs exprimés à la surface, endocytés et recyclés, en utilisant la microscopie confocale.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Dynamique des récepteurs
Contexte
- Comprendre la dynamique des récepteurs du glutamate est essentiel pour obtenir des informations sur la transmission synaptique.
- L'endocytose et le recyclage des récepteurs jouent un rôle important dans la signalisation neuronale.
- La microscopie confocale permet une visualisation détaillée de la localisation des récepteurs.
- Cette étude se concentre sur la méthodologie d'analyse de l'expression des récepteurs dans des neurones en culture.
Objectif de l'étude
- Étudier les mécanismes d'endocytose et de recyclage des récepteurs du glutamate.
- Différencier les récepteurs exprimés à la surface de ceux internalisés.
- Fournir un protocole détaillé aux chercheurs étudiant la dynamique des récepteurs.
Méthodes utilisées
- Préparation de cultures neuronales hippocampiques sur des lamelles.
- Application d'anticorps primaires pour marquer les récepteurs du glutamate.
- Utilisation de milieux conditionnés pour induire l'endocytose.
- Quantification de la dynamique des récepteurs par microscopie confocale.
Résultats principaux
- Marquage réussi des récepteurs du glutamate à la surface et après endocytose.
- Démonstration du recyclage des récepteurs dans des conditions spécifiques.
- Analyse quantitative de la localisation des récepteurs selon différents traitements.
- Validation du protocole pour des études futures sur la dynamique des récepteurs.
Conclusions
- Le protocole distingue efficacement les récepteurs situés à la surface de ceux qui sont internalisés.
- Les résultats contribuent à la compréhension du trafic des récepteurs du glutamate.
- Cette méthodologie peut être appliquée à diverses études en neurosciences.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Cette méthode permet une discrimination précise des populations de récepteurs du glutamate situés à la surface par rapport à ceux internalisés, contribuant ainsi à l'atténuation des risques mécanistiques lors de la validation de cibles dans les troubles du système nerveux central. En quantifiant la dynamique du trafic des récepteurs, elle offre une prédiction fiable pour l'évaluation des effets des composés sur la fonction synaptique et les voies de signalisation neuronale. L'approche facilite la découverte précoce en précisant le comportement des récepteurs soumis à des perturbations pharmacologiques ou génétiques pertinentes pour les indications neuropsychiatriques.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet d'étudier les mécanismes de trafic des récepteurs du glutamate afin de valider l'engagement fonctionnel de la cible.
- Valeur opérationnelle : Distingue les pools de récepteurs exprimés à la surface de ceux internalisés, grâce à un marquage différentiel par anticorps et à la conjugaison de fluorophores.
- Valeur prédictive : Facilite l'évaluation des modifications induites par des composés chimiques dans l'endocytose et le recyclage des récepteurs, en vue de l'optimisation de candidats médicaments.
Développement de criblages et de tests
- Prêt-à-l’emploi du test : Génère des lectures quantitatives par imagerie confocale des populations de récepteurs à la surface, endocytés et recyclés, dans des conditions contrôlées.
- Reproductibilité : Utilise une fixation, une perméabilisation et un marquage séquentiel par anticorps standardisés afin d'assurer une discrimination cohérente des sous-populations de récepteurs.
- Extensibilité : Compatible avec des formats multi-puits et l'imagerie automatisée, permettant un criblage à débit moyen de modulateurs pharmacologiques.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour les maladies : Le trafic des récepteurs du glutamate est impliqué dans les déficits de plasticité synaptique associés aux affections neurodégénératives et neuropsychiatriques.
- Continuité translationnelle : Établit un lien mécanistique entre la dynamique des récepteurs in vitro et les modèles précliniques de dysfonctionnement du système nerveux central.
- Atténuation des risques : Permet la détection précoce de composés perturbant le trafic des récepteurs, réduisant ainsi l'abandon en phase tardive dû à des effets neuronaux inattendus.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La technique s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation de la cible à l'identification de composés candidats, en offrant des éclairages mécanistiques qui éclairent les décisions concernant la progression des composés.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses sur les voies de trafic des récepteurs et permet de clarifier les effets des composés sur la localisation des récepteurs du glutamate.
- Criblage : Fournit des résultats quantitatifs prêts à l'analyse sur l'expression membranaire des récepteurs et les taux d'internalisation pour l'évaluation des composés.
- Analytique : Permet la comparaison des populations de récepteurs selon les traitements, à l'aide de la quantification par microscopie confocale, afin d'éclairer les évaluations de la relation structure-activité et de la puissance.
- Recherche translationnelle : Relie les données de trafic in vitro à la continuité préclinique en identifiant les composés capables de préserver ou de perturber le recyclage physiologique des récepteurs.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme réutilisable pour l'évaluation de composés ciblant le système nerveux central dans le cadre de plusieurs projets et classes de cibles.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Permet une détection mécanistique des risques en clarifiant si les composés modifient la disponibilité à la surface ou l'expression totale des récepteurs du glutamate.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité grâce à des protocoles standardisés d'incubation avec des anticorps, de perméabilisation et de marquage à double fluorophore.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions de poursuite ou d'abandon en révélant les mécanismes d'action subcellulaires pouvant prédire les effets fonctionnels dans les réseaux neuronaux.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation des composés ajustée au risque en fonction de leurs effets sur le recyclage des récepteurs, un déterminant clé de la résilience synaptique.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation des cultures primaires de neurones, l'étiquetage par anticorps et la microscopie confocale.
- Dépend de l'accès à des anticorps secondaires marqués par un fluorochrome, à des agents de perméabilisation (par exemple, Triton-X) et à des modulateurs de l'endocytose (par exemple, la dynasore).
- Exige une standardisation entre les équipes concernant le moment de la fixation, les concentrations en anticorps et les protocoles d'analyse d'images.
- L'adaptation à d'autres types de récepteurs ou à d'autres modèles neuronaux nécessite une validation de la spécificité des anticorps et des cinétiques de trafic intracellulaire.
- Les limites pratiques incluent la variabilité dans la préparation des cultures primaires et la nécessité d'une optimisation rigoureuse des étapes de blocage et de perméabilisation afin d'éviter les artéfacts.
F.A.Q. sur la bio-pharmacie
Murine lymphocytaire par étiquetage
Vidéos connexes
0 Vues
Un dosage de haute teneur de surveillance AMPA récepteur trafic
Vidéos connexes
0 Vues
Suivi du trafic de lymphocytes T induits par des anticorps bispécifiques à l’aide de lymphocytes T humains transduits par la luciférase
Vidéos connexes
0 Vues
Diffusion latérale et l'exocytose des protéines membranaires dans des neurones en culture évaluée à l'aide de récupération de fluorescence et de fluorescence de perte de photoblanchiment
Vidéos connexes
0 Vues
L'utilisation d'un α-bungarotoxine Reliure Tag du site à étudier récepteur GABA A membrane localisation et le trafic
Vidéos connexes
0 Vues
Combiné optogénétiques et Cryo-fracture Replica immunomarquage examiner l'aménagement spécifique à l'entrée de Glutamate Receptors dans l'amygdale Souris
Vidéos connexes
0 Vues
En utilisant biocapteurs à base d'enzymes pour mesurer Tonic et Phasic Glutamate dans les modèles murins d'Alzheimer
Vidéos connexes
0 Vues
Mesurer l’endocytose de la vésicule synaptique dans des neurones Hippocampal cultivés
Vidéos connexes
0 Vues
Un dosage de haut-débit-flux de Calcium pour l’étude des récepteurs NMDA avec sensibilité à la Glycine/D-sérine et Glutamate
Vidéos connexes
0 Vues
Une approche d'alimentation d'anticorps pour étudier le trafic de récepteurs de glutamate dans les cultures hippocampal primaires dissociées
Vidéos connexes
0 Vues
Dernière mise à jour : 22 août 2026