Évaluation de l’afflux de calcium induit par les récepteurs des lymphocytes T à l’aide d’un colorant indicateur de calcium
Encyclopédie des expériences JoVE
Immunologie
0 vues • 8:14 min • July 8th, 2025
Commencez par une suspension de lymphocytes T de souris et introduisez un colorant indicateur de calcium - ester indo-1-acétoxyméthyle.
Le colorant pénètre dans les cellules, où les estérases intracellulaires clivent le groupe acétoxyméthyle pour former de l’Indo-1 imperméable à la membrane, qui présente une fluorescence distincte dans les formes sans calcium et liées au calcium.
Ajoutez des anticorps du récepteur Fc pour bloquer les sites d’interaction non spécifiques.
Introduire des anticorps marqués au fluorophore pour colorer les sous-ensembles de lymphocytes T.
Éliminez les anticorps non liés et les colorez avec un colorant de viabilité qui colore différemment les cellules vivantes et mortes.
En cytométrie en flux, détectez d’abord la faible fluorescence des cellules vivantes et identifiez les cellules T marquées au fluorophore, puis mesurez la fluorescence Indo-1 dans ces cellules.
Traitez avec des anticorps anti-CD3, qui interagissent avec le complexe CD3 du récepteur des lymphocytes T et activent les voies de signalisation des lymphocytes T, induisant un afflux de calcium dans le cytosol.
Le colorant Indo-1 interagit avec les ions calcium libérés, faisant passer la fluoresc
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