Évaluation de l’afflux de calcium induit par les récepteurs des lymphocytes T à l’aide d’un colorant indicateur de calcium

Commencez par une suspension de lymphocytes T de souris et introduisez un colorant indicateur de calcium - ester indo-1-acétoxyméthyle.

Le colorant pénètre dans les cellules, où les estérases intracellulaires clivent le groupe acétoxyméthyle pour former de l’Indo-1 imperméable à la membrane, qui présente une fluorescence distincte dans les formes sans calcium et liées au calcium.

Ajoutez des anticorps du récepteur Fc pour bloquer les sites d’interaction non spécifiques.

Introduire des anticorps marqués au fluorophore pour colorer les sous-ensembles de lymphocytes T.

Éliminez les anticorps non liés et les colorez avec un colorant de viabilité qui colore différemment les cellules vivantes et mortes.

En cytométrie en flux, détectez d’abord la faible fluorescence des cellules vivantes et identifiez les cellules T marquées au fluorophore, puis mesurez la fluorescence Indo-1 dans ces cellules.

Traitez avec des anticorps anti-CD3, qui interagissent avec le complexe CD3 du récepteur des lymphocytes T et activent les voies de signalisation des lymphocytes T, induisant un afflux de calcium dans le cytosol.

Le colorant Indo-1 interagit avec les ions calcium libérés, faisant passer la fluorescence du colorant du bleu au violet.

Le passage de la fluorescence Indo-1 de l’état exempt de calcium à l’état lié au calcium confirme l’afflux de calcium induit par le récepteur des lymphocytes T.

Pour commencer, préparez une solution mère de 1 microgramme par microlitre d’Indo-1 AM en ajoutant 50 microlitres de DMSO dans un flacon contenant 50 microgrammes d’Indo-1 AM. Diluer la solution mère dans un volume approprié de cRPMI à une concentration de 6 microgrammes par millilitre.

Placez le milieu dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Ensuite, utilisez ce milieu pour diluer une suspension cellulaire préalablement préparée dans un rapport de 1 à 1 pour obtenir 5 à 6 millions de cellules par millilitre. Ensuite, dans une plaque de culture tissulaire à 12 puits, ajoutez 1 millilitre de suspension cellulaire par puits, dans des conditions expérimentales.

Préparez un échantillon de contrôle monocoloré pour l’Indo-1 AM sans calcium en ajoutant de l’EGTA aux cellules chargées de colorant Indo-1. Réparer un puits pour un contrôle biologique négatif sans fluorophores ni colorant Indo-1. Préparez un témoin positif pour l’Indo-1 en ajoutant de l’ionomycine à une concentration de 50 micromoles à la suspension cellulaire chargée de colorant au niveau du cytomètre en flux.

Préparez également un puits pour les contrôles à coloration unique pour des populations cellulaires supplémentaires, en utilisant des fluorophores conjugués aux anticorps. Ajoutez ensuite 2 microgrammes d’anticorps bloquant les récepteurs FC par million de cellules et incubez la plaque pendant 45 minutes, en tapotant toutes les 15 minutes pour remettre les cellules en suspension.

Après l’incubation, mélangez et retirez tout le volume de cellules de la plaque et ajoutez-le dans des tubes de microcentrifugation de 1,7 millilitre. Centrifuger et décanter le surnageant. Une fois que les cellules sont lavées avec 1 millilitre de cRPMI préchauffé, granulez à nouveau et décantez le surnageant.

Remettez les cellules en suspension dans 1 millilitre de cRPMI et incubez chaque tube, en laissant le haut du tube légèrement ouvert pour l’échange gazeux, permettant une désestérification complète des esters AM intracellulaires. Ensuite, préparez un mélange principal de tous les anticorps conjugués au fluorochrome définis par l’utilisateur et ajoutez-le aux cellules au repos pour 1 millilitre du volume cellulaire.

Après le repos, granulez les cellules et lavez la pastille en la remettant en suspension dans 1 millilitre de cRPMI refroidi à 4 degrés Celsius. Répétez cette étape et placez les tubes sur de la glace. Remettre en suspension des échantillons individuels dans 500 microlitres de cRPMI sans rouge de phénol, à l’aide d’un tube d’écoulement en polystyrène de 5 millilitres avec un bouchon.

Pour maintenir la température à l’aide de l’analyse du flux de calcium, préparez un bain de billes en ajoutant des billes de bain dans un petit bain d’eau et réchauffez-le à 37 degrés Celsius. Coupez soigneusement un tube conique de 50 millilitres en deux et jetez le haut du tube. Remplissez les 3/4 du tube restant avec des perles de bain et laissez-le atteindre 37 degrés Celsius dans le bain de perles.

Placez le bain de billes près d’un cytomètre en flux, ainsi qu’un support en polystyrène pour positionner le tube. Avant l’analyse sur le cytomètre en flux, réchauffez les tubes individuellement à 37 degrés Celsius pendant sept minutes. Connectez-vous au logiciel de cytomètre en flux et cliquez sur l’onglet Bibliothèque.

Ensuite, sélectionnez des étiquettes fluorescentes pour ajouter de l’Indo-1 lié au calcium et de l’Indo-1 sans calcium. Ensuite, sélectionnez Laser UV sous Groupes d’étiquettes fluorescentes, puis cliquez sur Ajouter plus pour ajouter un nom d’étiquette fluorescente. Choisissez la longueur d’onde d’excitation et d’émission laser, puis cliquez sur Enregistrer.

Passez à la configuration de l’expérience. cliquez sur l’onglet Acquisition. Ouvrez ou créez une nouvelle expérience, puis ajoutez les étiquettes fluorescentes souhaitées à l’expérience. Créez un groupe de référence et un nouveau groupe d’échantillons pour l’expérience, et étiquetez les deux groupes.

Sous l’onglet Acquisitions, définissez les événements à enregistrer au maximum à 10 millions, le volume d’arrêt au volume maximal de 3 000 microlitres et le temps d’arrêt au maximum de 36 000 secondes. Acquérez des commandes monocoloriées pour les anticorps conjugués définis par l’utilisateur, inclus dans le panneau multicolore, et pour le colorant fonctionnel Indo-1.

Ajoutez 50 micromoles d’ionomycine au contrôle positif Indo-1 lié au calcium et au vortex. Ajoutez le tube d’écoulement à la carte d’injection d’échantillon, puis cliquez sur Enregistrer. Ensuite, ajoutez le contrôle négatif Indo-1 sans calcium au cytomètre en flux, puis cliquez sur Enregistrer.

Démixez les commandes monochromes en cliquant sur le bouton Dissocier. Une fois le démélange terminé, créez des tracés séquentiels à l’aide de la feuille de travail non mélangée, tels que SSCA ou FSCA pour éliminer les débris de l’échantillon, et SSCA ou SSCH pour éliminer les doublets.

Créez ensuite des portails en cliquant sur Parcelle. Ajoutez un graphique à la feuille de calcul et double-cliquez à l’intérieur de la porte pour créer une population fermée en aval. Continuez jusqu’à ce que toutes les populations d’intérêt soient prises en compte. Ensuite, réchauffez les échantillons de contrôle monocolorés préalablement préparés à 37 degrés Celsius pour une analyse séquentielle.

Configurez le logiciel de cytométrie en flux et faites fonctionner de l’eau déminéralisée pendant 2 à 3 minutes pour assurer la stabilité fluidique du cytomètre en flux. Configurez des tracés séquentiels sur la feuille de calcul non mixte en créant des points de contrôle à l’aide des boutons de porte polygone, rectangulaire ou elliptique pour inclure la population d’intérêt.

Double-cliquez à l’intérieur de la porte et modifiez les paramètres des axes y et x en SSCA ou SSCH. Terminez la définition des paramètres de l’axe en cliquant avec le bouton gauche de la souris sur l’axe. Créez une parcelle avec le signal de colorant SSCA par rapport à la viabilité. Gate les cellules vivantes, qui sont négatives ou colorées par des colorants amines.

Les cellules vivantes négatives pour la coloration des cellules mortes vivantes se regrouperont au repère zéro sur les axes des y et des x. Double-cliquez sur le graphique intérieur pour créer un nouveau graphique, contenant uniquement des lymphocytes vivants unicellulaires. Changez l’axe des y en un en fonction du temps sur l’axe des x pour visualiser l’afflux de calcium.

Ensuite, placez l’échantillon biologique réchauffé dans le SIT de la machine. Analysez les échantillons à une vitesse de 2 500 à 3 000 événements par seconde à un débit moyen pour visualiser l’afflux de calcium dans un nombre limité de populations cellulaires. Ajoutez le tube suivant dans le bain de billes.

Dans le contrôle d’acquisition, appuyez sur Enregistrer pour enregistrer les données initiales pendant 30 secondes afin d’obtenir un niveau basal de signalisation calcique dans l’échantillon. Cliquez ensuite sur Arrêter et retirez le tube du port d’injection d’échantillon. Ajoutez 30 microgrammes d’anti-CD3 non conjugué directement dans le tube d’échantillon pour initier l’afflux de calcium.

Replacez rapidement le tube sur l’orifice d’injection d’échantillon et appuyez sur Enregistrer dans le logiciel. Enregistrez les données pendant sept minutes, en regardant le temps écoulé sous les commandes d’acquisition du logiciel. Appuyez ensuite sur Stop dans le logiciel.