Un dosage immunologique par électrophorèse capillaire pour la détection de biomarqueurs protéiques

Pour détecter un biomarqueur protéique associé à une maladie, prenez une plaque d’immunodosage.

La plaque contient des matrices de séparation et d’empilement préremplies nécessaires à la séparation des protéines en fonction de la taille.

Chargez les protéines et les réactifs d’immunodosage dans des puits de plaque distincts.

Lancez l’exécution à l’intérieur d’un analyseur CEI. La cartouche capillaire de l’analyseur aspire les matrices pour former un gel à l’intérieur de chaque capillaire.

Le capillaire aspire ensuite les protéines. Lors de l’électrophorèse, les protéines migrent et se séparent en fonction de leur poids moléculaire.

L’analyseur introduit la lumière UV, immobilisant les protéines dans le capillaire.

Le tampon de lavage élimine les matrices et les protéines non liées. La mémoire tampon de blocage s’écoule ensuite, bloquant les sites d’interaction non spécifiques.

L’analyseur introduit des anticorps primaires qui se lient au biomarqueur, suivis d’anticorps secondaires conjugués à la peroxydase interagissant avec les anticorps primaires.

Lavez puis ajoutez le substrat de chimiluminescence. La peroxydase oxyde le substrat en émettant une luminescence.

Mesurez l’intensité de la luminescence et comparez-la à l’étalon protéique pour la détection des biomarqueurs.

Après avoir collecté 100 microlitres de lysats de plaquettes humaines auprès de patients atteints de SLA et de sujets sains, remplissez des modèles générés en interne pour la disposition capillaire et la préparation des échantillons. La table de préparation du mélange d’échantillons est dynamique et calcule automatiquement le volume à retirer de la source. Placez tous les réactifs de dosage sur de la glace, à l’exception de l’emballage standard qui doit rester à température ambiante.

Pour préparer le mélange maître fluorescent, ajoutez 40 microlitres d’eau déminéralisée dans un tube transparent de DTT, et ajoutez 20 microlitres de tampon d’échantillon 10X et 20 microlitres de la solution de DTT préparée de 400 millimolaires dans le tube rose du kit de dosage.

Pour préparer l’échelle biotinylée, ajoutez 16 microlitres d’eau désionisée, 2 microlitres de tampon d’échantillon 10X et 2 microlitres de la solution DTT préparée de 400 millimolaires dans le tube blanc fourni dans le kit. Après un mélange doux, transférez la solution d’échelle dans un tube PCR de 200 microlitres avant de dénaturer.

Ajoutez 1,5 microlitre de tampon d’échantillon 10X et 148,5 microlitres d’eau désionisée dans un tube de microcentrifugation de 600 microlitres. Et vortex à mélanger, avant de placer le tube sur de la glace. Ajoutez les anticorps d’intérêt directement dans le diluant, comme indiqué dans le tableau, et rincez la pointe de la pipette plusieurs fois pour obtenir une solution d’anticorps homogène.

Pour préparer le mélange d’échantillons capillaires, ouvrez tous les tubes PCR et ajoutez des aliquotes de 1,6 microlitre de tampon d’échantillon fluorescent 5X dans chaque tube, comme indiqué dans le tableau, en utilisant une technique de pipetage inverse, en fermant immédiatement chaque tube au fur et à mesure que le tampon est ajouté. Lorsque toute la mémoire tampon a été ajoutée, ouvrez tous les tubes et ajoutez une mémoire tampon d’échantillon de 0,1x dans les volumes indiqués dans le tableau, en fermant immédiatement chaque tube au fur et à mesure que la mémoire tampon est ajoutée.

Ensuite, ouvrez tous les tubes, ajoutez les échantillons de protéines comme indiqué dans le tableau, et fermez immédiatement chaque bouchon de tube. Lorsque tous les échantillons ont été ajoutés, centrifugez brièvement tous les tubes dans une centrifugeuse de paillasse. Vortex pour mélanger et centrifuger à nouveau les échantillons.

À la fin de la deuxième centrifugation, placez tous les tubes dans un thermocycleur avec un couvercle chauffé et dénaturez les échantillons dans les conditions indiquées. À la fin de la dénaturation, centrifugez, mélangez et centrifugez à nouveau les échantillons, et placez tous les tubes dans un support à tubes sur de la glace.

En utilisant la figure comme guide, ajoutez 10 microlitres de streptavidine de raifort peroxydase dans le puits D1, 10 microlitres de l’anticorps secondaire approprié dans les puits D2 à D5, 10 microlitres de diluant d’anticorps dans chaque puits de la rangée B et dans le puits C1, 10 microlitres de l’anticorps primaire approprié dans les puits C2 à C25, 5 microlitres d’échelle biotinylée du tube PCR numéro 1 vers le puits A1, 3 microlitres d’échantillon aux rangées A2 à A25, et 15 microlitres de peroxyde de luminol fraîchement préparé à chaque puits de la rangée E.

Le pipetage du mélange d’échantillons et des réactifs dans le minuscule puits dans le bon ordre est essentiel au succès de l’expérience, il doit donc être fait très soigneusement.

Ajoutez ensuite 500 microlitres de tampon de lavage dans chaque puits de tampon de lavage désigné et essorez le contenu de la plaque par centrifugation.