Imagerie par immunofluorescence multiplexée pour analyser les sous-populations de lymphocytes T résistants à l’immunothérapie

Prenons l’exemple d’une cryosection tissulaire de carcinome rénal présentant des lymphocytes T CD8+ infiltrants dans son microenvironnement tumoral.

Traitez-le avec de l’acétone pour fixer et perméabiliser les tissus. Laver pour enlever l’excès d’acétone.

Ajoutez de l’avidine pour saturer la biotine du tissu endogène. Ensuite, ajoutez de la biotine pour bloquer les sites de liaison à l’avidine immobilisés, minimisant ainsi les interactions non spécifiques.

Appliquez du sérum contenant des immunoglobulines pour bloquer les récepteurs Fc des cellules immunitaires, empêchant ainsi la liaison d’anticorps non spécifiques.

Ajouter un cocktail d’anticorps primaires ciblant CD8, un marqueur cytotoxique des lymphocytes T, et-1 et Tim-3, récepteurs inhibiteurs exprimés par les sous-populations de lymphocytes T CD8+ résistantes à l’immunothérapie.

Introduire des anticorps secondaires distincts marqués au fluorophore ciblant les anticorps anti-CD8 et anti-Tim-3.

Ajoutez des anticorps secondaires biotinylés ciblant les anticorps anti--1 et une autre streptivideine marquée au fluorophore se liant à la biotine.

Appliquez un agent d’enrobage contenant un colorant pour colorer les noyaux cellulaires et placez une lamelle.

Acquérez des images de fluorescence multispectrales pour identifier les lymphocytes T CD8+ infiltrant la tumeur et les sous-populations résistantes à l’immunothérapie exprimant-1, Tim-3 ou les deux.

Après la décongélation, utilisez une serviette en papier pour sécher soigneusement les lames autour des sections de tissus et encerclez les tissus avec un stylo barrière hydrophobe. Lorsque la barrière a séché, fixez les échantillons dans de l’acétone à 100 % pendant 5 minutes, puis séchez-les à l’air pendant 2 minutes. Ensuite, lavez les lames dans TBS pendant 10 minutes.

Prétraitez les lames avec trois gouttes d’avidin à 0,1 % pendant 10 minutes dans l’obscurité. Ensuite, tapotez ou effleurez les lames pour couvrir le tissu avec la solution d’avidine. Ajoutez trois gouttes de biotine à 0,01 % à chaque échantillon, et tapotez ou effleurez la biotine sur les échantillons, suivie d’un lavage au TBS, comme nous venons de le démontrer. Ensuite, bloquez toute liaison non spécifique avec 100 microlitres de sérum normal à 5 % dans du TBS pendant 30 minutes à température ambiante.

À la fin de l’incubation, tapotez les lames pour éliminer l’excès de sérum, et incubez les lames dans 100 microlitres du cocktail d’anticorps primaire d’intérêt pendant 1 heure dans une chambre humidifiée. Lavez les lames marquées d’anticorps dans du TBST pendant 5 minutes.

Après le séchage, étiquetez les cellules avec 100 microlitres du cocktail d’anticorps secondaires d’intérêt pendant 30 minutes dans la chambre humidifiée, suivie d’un lavage de 10 minutes dans du TBS. Incuber les lames d’anticorps secondaires séchés marquées avec 100 microlitres du cocktail d’anticorps tertiaires d’intérêt pendant 30 minutes, suivi d’un lavage final de 10 minutes au TBS.

À la fin du lavage, séchez les lames et montez les mouchoirs avec le support de montage complété par le DAPI. Ensuite, couvrez chaque diapositive avec une lamelle et laissez le support de montage reposer pendant au moins 2 heures.

Pour numériser les lames, ouvrez le logiciel du microscope et chargez le protocole de balayage d’image. Chargez la première lame sur la platine du microscope. Ensuite, dans la barre des commandes, cliquez sur Régler l’exposition et ajustez le temps d’exposition de chaque filtre jusqu’à ce qu’un signal suffisant mais non saturé soit obtenu.

Cliquez sur Démarrer dans le panneau supérieur et ouvrez le dossier d’ID de laboratoire. Entrez l’ID de la première diapositive, puis cliquez sur Suivant.

Pour obtenir la vue d’ensemble de la lame sous une lumière de champ vif avec un grossissement de 4x, cliquez sur Imagerie monochrome et Rechercher l’échantillon. Pour sélectionner la zone de tissu à scanner, appuyez sur la touche Ctrl et utilisez le curseur pour sélectionner ou désélectionner les régions d’intérêt à numériser avec un grossissement de 4x.

Pour obtenir une image fluorescente rouge-bleu-vert de chaque région, cliquez sur Imagerie basse consommation. Pour la sélection de champs à haute puissance, appuyez sur la touche Contrôle et sélectionnez au moins cinq régions d’intérêt qui correspondent aux zones du tissu qui seront balayées avec un grossissement de 20x.

Ensuite, pour obtenir une acquisition d’image multispectrale de chaque champ, cliquez sur Imagerie haute puissance, puis sur Stockage de données pour stocker les images dans le dossier d’ID de laboratoire approprié.