Une technique d’immunofluorescence pour la localisation de protéines virales dans des cellules infectées

Commencez par une lame contenant des cellules hôtes collées.

Ajoutez des virus et laissez-les pénétrer dans les cellules hôtes.

Retirez le produit usé. Ajouter un milieu frais pour permettre la synthèse et le transport des protéines virales.

Utilisez du paraformaldéhyde pour préserver la morphologie cellulaire et l’emplacement des protéines.

Ajoutez des molécules de détergent pour rendre les cellules perméables.

Appliquez une mémoire tampon de blocage pour bloquer les sites de liaison non cibles.

Ajoutez des anticorps primaires qui se lient aux protéines virales cibles. Retirez les anticorps non liés.

Superposition d’anticorps secondaires conjugués au fluorophore rouge pour le marquage fluorescent des protéines virales. Retirez les anticorps non liés.

Ajoutez un produit de montage contenant un colorant nucléaire fluorescent pour colorer les noyaux.

À l’aide de la microscopie confocale, observez l’emplacement des protéines virales fluorescentes rouges et des noyaux hôtes fluorescents bleus.

Un signal rouge plus fort autour de la zone bleue indique une localisation cytoplasmique, tandis qu’un signal plus fort à l’intérieur suggère une localisation nucléaire.

Des niveaux de signal égaux dans et autour de la zone bleue indiquent que les protéines sont situées à la fois dans le noyau et le cytoplasme.

20 à 24 heures avant l’infection virale, ensemencez 5 x 10⁴ cellules de poumons embryonnaires humains ou de fibroblastes HEL par puits sur une lame décalée de 4 puits de 11 millimètres dans un milieu de croissance pour une incubation d’une nuit à 37 degrés Celsius, avec 5 % de dioxyde de carbone.

Il est important de bien balancer la lame pour assurer une répartition uniforme des cellules tout en prenant soin de ne pas renverser le milieu de culture. Le lendemain, remplacez les surnageants des cultures confluentes de 70 % à 80 % par du Medium-199 contenant 4 à 10 unités formant des plaques par cellule, et placez la lame à 37 degrés Celsius en l’agitant pendant 1 heure.

À la fin de l’incubation, remplacez les surnageants par un milieu de croissance frais et retournez les cellules dans l’incubateur pour la période d’infection expérimentale appropriée. Pour la coloration par immunofluorescence des cellules infectées par le virus, laver rapidement les cellules trois fois avec du PBS, suivies d’une incubation de 8 à 10 minutes dans 200 microlitres de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS par puits. À la fin de la fixation, lavez les cellules trois fois avec 200 microlitres de PBS par lavage et perméabilisez les cellules avec 100 microlitres de tensioactif non ionique à 0,2 % par puits pendant 5 à 10 minutes.

Lavez les cellules perméabilisées trois fois dans du PBS comme démontré, et ajoutez 200 microlitres de tampon de blocage dans chaque puits pour une incubation de 1 heure à température ambiante. Ensuite, ajoutez la concentration appropriée de l’anticorps primaire d’intérêt dans chaque puits pour une incubation de 2 heures à température ambiante.

À la fin de l’incubation, retirer tout anticorps primaire non lié en trois lavages de 10 minutes dans un nouveau tampon de blocage, et ajouter un anticorps secondaire approprié dans chaque puits pour une incubation de 1 heure à température ambiante, à l’abri de la lumière.

À la fin de l’incubation, laver les cellules trois fois dans un tampon de blocage comme démontré, suivi d’un lavage dans du PBS, et ajouter une goutte de milieu de montage anti-décoloration, complétée par du DAPI dans chaque puits. Placez ensuite une lamelle sur la lame et scellez-la avec du vernis à ongles transparent.

L’application d’une légère pression lors du montage de la lamelle permet d’éliminer tout support de montage en excès, ce qui permet d’obtenir des images de haute qualité.

Pour analyser la distribution nucléaire et cytoplasmique d’ICP0, ouvrez le projet dans le logiciel d’application confocal et sélectionnez une image. Ouvrez l’onglet Quantité et sélectionnez Trier les régions d’intérêt dans le menu Outils. Sélectionnez Dessiner une ligne et tracez une ligne longitudinale à travers la cellule à analyser. Un histogramme apparaîtra montrant l’intensité de fluorescence le long de la ligne pour la protéine d’intérêt et le DAPI.

Sur la base de la coloration de fond, établir un seuil constant pour l’intensité de la protéine d’intérêt pour l’analyse de la distribution subcellulaire de la protéine dans chaque expérience. Si le signal protéique, en moyenne, est inférieur au seuil dans la région nucléaire, mais est supérieur au seuil au-delà de la limite DAPI, classez le signal protéique comme principalement situé dans le cytoplasme.

Si le signal protéique est supérieur au seuil dans tout le noyau et au-delà de la limite du signal DAPI, regroupez le signal protéique en un noyau plus une localisation cytoplasmique. Si le signal protéique est supérieur au seuil dans le noyau, mais qu’il est en moyenne inférieur au seuil en dehors de la limite du signal DAPI, regroupez le signal protéique en tant que localisation nucléaire.