Mesure des taux d’immunoglobulines G par rapport à un vaccin test dans un sérum de souris

Commencer avec une plaque multi-puits recouverte d’un vaccin d’essai et bloquer les sites d’interaction non spécifiques.

Obtenez un échantillon de sérum d’une souris à qui on a injecté le vaccin testé.

Ce sérum contient des anticorps d’immunoglobuline G, ou IgG, qui reconnaissent le vaccin testé.

Dans les puits recouverts de vaccin, ajoutez des échantillons de sérum dilués en série.

Les IgG se lient au vaccin. Laver pour éliminer les anticorps non liés.

Ajoutez des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase qui se lient aux IgG. Retirer les anticorps secondaires non liés.

Ajouter un substrat chromogène. La peroxydase interagit avec le substrat, générant un produit de couleur bleue.

Introduisez un acide pour arrêter la réaction. Le changement de pH rend la solution jaune.

À l’aide d’un spectrophotomètre, mesurez l’intensité de la couleur de chaque puits pour déterminer la concentration d’IgG dans l’échantillon de sérum.

Pour l’enrobage de l’antigène du test immuno-enzymatique, ou plaque ELISA, diluez l’antigène de la protéine HI à 10 microgrammes par millilitre avec une solution d’enrobage, et ajoutez 100 microlitres de l’antigène dilué par puits dans la plaque ELISA. Incuber l’assiette à 4 degrés Celsius pendant la nuit. Après l’incubation, laver la plaque avec 300 microlitres de PBST par puits.

Scellez les puits avec 300 microlitres de solution d’étanchéité par puits pendant deux heures à 37 degrés Celsius. Ensuite, diluez 100 fois trois microlitres de sérum de souris de chaque groupe expérimental en ajoutant 297 microlitres de PBST, et vortex le sérum dilué. Ajouter 100 microlitres de sérum dilué par puits dans la plaque ELISA revêtue pour chaque échantillon de sérum. De même, diluez les sérums de contrôle positif et négatif 100 fois avec du PBST, en ajoutant 4 microlitres de sérum de contrôle positif ou négatif à 396 microlitres de PBST suivi d’un mélange vortex.

Pour effectuer une dilution à double rapport, ajoutez 200 microlitres du sérum expérimental préalablement dilué à la première rangée de la plaque ELISA revêtue. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de PBST dans tous les puits, sauf ceux des rangées un et 12. Ensuite, ajustez le pistolet pipette à 100 microlitres et transférez 100 microlitres de sérum de la première rangée à la deuxième rangée contenant du PBST.

Mélangez 10 fois le contenu de la deuxième rangée à l’aide du pistolet à pipette. De même, effectuez des dilutions successives 1:2 du sérum jusqu’à la rangée 11. Une fois cela fait, jetez 100 microlitres de liquide de la rangée 11.

Ajoutez 100 microlitres de sérum négatif et positif dilué dans chaque puits correspondant de la rangée 12, en suivant le modèle d’échantillon. Fermez la plaque ELISA avec une pellicule plastique et incubez à 37 degrés Celsius pendant une heure. Pendant ce temps, diluez 10 000 fois l’anticorps secondaire anti-souris IgG HRP en ajoutant du PBST. Après l’incubation d’une heure, lavez la plaque ELISA avec 300 microlitres de PBST par puits pour nettoyer les anticorps non liés. Ajoutez ensuite 100 microlitres de l’anticorps secondaire dilué dans chaque puits et incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 40 minutes.

Lavez la plaque avec 300 microlitres de PBST, par puits. Ajoutez ensuite 100 microlitres de solution de développement de couleur TMB dans chaque puits. Placez les assiettes à 37 degrés Celsius et à l’abri de la lumière pendant 10 minutes. Après quoi, terminez immédiatement la réaction avec 50 microlitres d’acide sulfurique 2 molaires. Détectez les valeurs de densité optique ou de DO à 450 nanomètres, à l’aide d’un marqueur enzymatique dans les 15 minutes suivant la fin de l’opération.