Évaluation du clivage médié par la caspase des protéines virales et de l’hôte dans les cellules infectées par le virus

Commencez par des cellules de mammifères infectées par le virus qui produisent plusieurs caspases, dont la caspase-3.

Ajouter un milieu de croissance dans le puits témoin et un milieu complété par un inhibiteur de la caspase-3 dans le puits d’essai.

Dans le puits témoin, la caspase-3 reconnaît et dégrade les nucléoprotéines virales et les protéines de l’hôte essentielles à la propagation virale.

Dans le puits de test, l’inhibiteur pénètre dans la cellule, inhibant l’activité de la caspase-3 et empêchant la dégradation des protéines.

Délogez les cellules de la plaque. Ajoutez un réactif de lyse et de la chaleur pour induire la lyse cellulaire, libérant des protéines intracellulaires.

Chargez les deux échantillons sur un gel de polyacrylamide SDS et de l’électrophorèse pour séparer les protéines en fonction de leur taille.

Après l’électrophorèse, transférez le gel sur une membrane buvard.

Traitez la membrane avec des anticorps primaires contre les nucléoprotéines virales et les protéines de l’hôte.

Laver et superposer avec des anticorps secondaires conjugués aux fluorophores qui se lient aux anticorps primaires, générant des bandes fluorescentes.

La fluorescence plus élevée dans l’échantillon de test indique une réduction du clivage des protéines virales et de l’hôte médié par la caspase-3 par rapport au témoin.

Pour commencer, ensemencez des cellules MDCK ou A549 dans une plaque de culture cellulaire à 12 puits, incubez les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius sous une atmosphère de dioxyde de carbone à 5 %. Le lendemain, retirez l’ancien milieu de culture des cellules et lavez les cellules dans chaque puits deux fois avec 1 millilitre de MEM sans sérum.

Ensuite, infectez les cellules en ajoutant 400 microlitres d’inoculum du virus de la grippe A et placez la plaque pour l’incubation pendant une heure. Après l’incubation, retirez l’inoculum viral et lavez les cellules avec du MEM. Ajoutez 1 millilitre de MEM sans sérum dans chaque puits et incubez les cellules comme indiqué à l’étape précédente.

Après 24 heures, récoltez les cellules en les grattant avec un piston de seringue de 1 millilitre et transférez-les dans un tube de 1,5 millilitre. Centrifugez le tube à 12 000 g pendant deux minutes à température ambiante et récupérez le surnageant. Lavez la pastille cellulaire avec 250 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate et centrifugez. Retirez le surnageant et ajoutez 100 microlitres de tampon de lyse cellulaire. Mélange par vortex.

Chauffez le tube à 98 degrés Celsius pendant 10 minutes pour lyser complètement les cellules. Ensuite, éliminez des quantités égales de protéines à partir d’échantillons non infectés et infectés par électrophorèse standard sur gel de polyacrylamide SDS. Après l’électrophorèse, transférez le gel protéique sur une membrane de nitrocellulose ou de PVDF et effectuez un western blot. Comparez les niveaux de protéines dans les voies d’échantillonnage infectées traitées par simulation et par inhibiteur.