Génération d’un modèle murin BLT (Os-Marrow, Foie, Thymus) doublement humanisé

Commencez avec une souris anesthésiée, immunodéficiente et dépourvue de cellules immunitaires.

Traitez la souris avec une dose sublétale de rayons X pour éliminer les cellules souches existantes de la moelle osseuse.

Disséquez la souris et libérez des fragments de tissu hépatique et thymique fœtal humain entre le rein et sa capsule.

Fermez l’incision.

Le tissu implanté du foie et du thymus se développe, formant des organoïdes, qui sont des agrégats cellulaires ressemblant à un organe.

Après la récupération, injectez des cellules souches hématopoïétiques humaines ou CSH dans la veine de la queue.

Les CSH injectées migrent vers l’organoïde du thymus et la moelle osseuse, se différenciant en diverses cellules immunitaires humaines.

Fournissez à la souris de l’eau complétée par des antibiotiques pour tuer les microbes intestinaux existants.

À l’aide d’un tube buccal, introduisez des microbes fécaux humains directement dans l’intestin de la souris pour favoriser la colonisation microbienne.

Cela se traduit par le développement d’un double modèle de souris BLT humanisé mettant en vedette un système immunitaire humain et des microbes intestinaux.

Pour implanter les tissus du foie et du thymus dans la capsule rénale gauche, placez d’abord la souris dans une capuche. Le jour de l’opération, traitez les souris avec une irradiation sublétale du corps entier à une dose de 12 centi-gris par gramme de poids corporel. Rasez chaque souris sur le côté latéral gauche et le côté médial après avoir confirmé un niveau de sédation approprié. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux de l’animal, et appliquez une étiquette d’oreille au besoin, et désinfectez la peau avec trois gommages séquentiels à l’iode et à l’isopropanol à 70 %.

Lorsque la peau a été préparée, utilisez une pince pour charger un fragment de tissu hépatique fœtal humain de 1 à 1,6 millimètre cube dans un trocart, suivi d’un fragment de tissu de thymus fœtal humain de 1 à 1,6 millimètre cube. Utilisez la pince pour soulever la peau et utilisez un scalpel pour faire une petite incision longitudinale dans la peau. Étendez la coupe à 1,5 à 2 centimètres sur le côté gauche de la souris et utilisez une pince pour soulever la couche musculaire. Utilisez des ciseaux pour ouvrir la couche musculaire longitudinalement, en prolongeant la coupe si nécessaire, pour exposer le rein et saisir doucement le tissu adipeux entourant le rein.

À l’aide d’un scalpel, faites une incision de 1 à 2 millimètres à l’extrémité postérieure de la capsule rénale et insérez lentement le trocart préchargé dans l’incision, parallèlement à l’axe long du rein. Relâchez les tissus entre la capsule rénale et le rein, et remettez le rein et l’intestin dans leurs positions normales. Ensuite, utilisez des sutures pour fermer la couche musculaire et des agrafes chirurgicales pour fermer la peau. Placez la souris dans une cage de micro-isolateur autoclavée avec surveillance jusqu’à ce qu’elle soit complètement couchée. Six heures après l’opération, placez les souris sous une lampe chauffante et désinfectez les contes avec de l’isopropanol à 70 %.

Injecter 1,5 à 5 x 10⁵ CD34-positif de tissu hépatique fœtal humain isolé dans 200 microlitres de PBS dans une veine de queue dilatée par animal. Ensuite, arrêtez tout saignement avec une légère pression et remettez les souris dans leur cage d’origine. 9 à 12 semaines après la chirurgie, utilisez un cône de contention en plastique de taille appropriée pour isoler une patte d’une souris humanisée et vaporisez le côté médial de la jambe isolée avec 70 % d’isopropanol. Étalez un antibiotique et une pommade analgésique sur le site de collecte.

À l’aide d’une aiguille de calibre 25 tenue à un angle de 90 degrés, percez la veine saphène pour recueillir 50 à 100 microlitres de sang dans un tube de prélèvement sanguin recouvert d’EDTA. Lorsqu’un volume de sang approprié a été obtenu, appliquez une pression sur le site avec le morceau de gaze stérile pour arrêter le saignement avant de remettre la souris dans sa cage. Ensuite, utilisez l’échantillon de sang périphérique recueilli pour évaluer le niveau de reconstitution des cellules immunitaires humaines par cytométrie en flux, en utilisant des anticorps contre CD45, CD3, CD4, CD8, CD19 et CD45 de souris.

Pour le prélèvement d’échantillons de matières fécales fraîches, placez des sacs en papier autoclavés individuels dans une hotte et placez une souris dans chaque sac jusqu’à ce que chaque animal défèque. Ensuite, remettez les souris dans leur cage et utilisez des pinces stériles pour transférer chaque échantillon fécal dans un tube de 1,5 millilitre par souris pour un stockage à moins 80 degrés Celsius.

À la fin du traitement antibiotique de 14 jours, remplacez l’eau de boisson par de l’eau stérilisée autoclavée et transférez les souris dans une nouvelle cage autoclave. 24 et 48 heures après l’arrêt des antibiotiques, remplissez les sources de microbiote fécal correctement préparées et aliquotez les échantillons dans une chambre anaérobie dans des conditions anaérobies.

Pour effectuer une transplantation fécale, administrez 200 microlitres de matériel de transplantation de microbiote fécal par gavage oral à chaque animal de laboratoire, et étalez tout matériel décongelé restant sur la fourrure des souris humanisées ou sur la litière de la cage.