Une technique pour cultiver les neurones de l’hippocampe de souris

Prenez un hippocampe de bébé souris récolté dans une zone tampon.

Coupez l’hippocampe en petits fragments et transférez-les dans un tube conique.

Lavez le mouchoir avec un tampon. Une fois que les fragments se déposent, retirez le tampon. Maintenant, ajoutez un nouveau tampon et de la trypsine.

Pendant l’incubation, la trypsine, une enzyme protéolytique, digère la matrice extracellulaire du tissu, relâchant les neurones de l’hippocampe.

Lavez le tissu digéré avec un tampon.

Une fois que les fragments se déposent, retirez le tampon. Ajoutez un tampon frais et pipetez le tissu à plusieurs reprises pour le dissocier mécaniquement, obtenant ainsi une suspension unicellulaire.

Une fois que le tissu non digéré se dépose, transférez la suspension cellulaire sur des lamelles enrobées de poly-L-lysine avec des supports de cire à l’intérieur d’une plaque de culture contenant du milieu.

Les cellules se fixent aux surfaces recouvertes de poly-L-lysine par des interactions électrostatiques.

Maintenant, placez les lamelles adhérées aux neurones vers le bas dans une boîte contenant des cellules gliales corticales ou non neuronales dans un milieu sans sérum.

En culture, les supports de cire empêchent le contact direct entre les neurones et les cellules gliales, créant ainsi un microenvironnement où les facteurs sécrétés par les cellules gliales favorisent la survie et la maturation neuronales.

Pour commencer, disséquez six à huit hippocampes de chiots postnatals d’un jour avec HBSS medium dans une boîte de Pétri. Hachez l’hippocampe avec des ciseaux de dissection en petits morceaux et transférez-les du plat dans un tube de 15 millilitres. Lavez l’hippocampe deux fois avec 5 millilitres de HBSS et laissez-les dans 4,5 millilitres de HBSS après le lavage.

Ajoutez 0,5 millilitre de trypsine à 2,5 % dans 4,5 millilitres de HBSS et incubez dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes, en inversant le tube toutes les 5 minutes. L’hippocampe bien digéré doit devenir collant et former une grappe. Si nécessaire, prolongez la digestion pendant 5 minutes supplémentaires.

Lavez l’hippocampe avec HBSS trois fois pendant 5 minutes par lavage. Après le lavage, ajoutez 2 millilitres de HBSS et pipetez l’hippocampe de haut en bas avec une pipette Pasteur 15 fois. Triturez le tissu avec une pipette Pasteur polie au feu 10 fois et laissez reposer le tube pendant cinq minutes jusqu’à ce que tous les morceaux prennent au fond. Répétez la trituration avec les morceaux restants jusqu’à ce que la plupart d’entre eux aient disparu.

Ensuite, à l’aide d’une pointe de pipette de 1 millilitre, transférez doucement le surnageant contenant les neurones dissociés dans des plats de placage. Ajoutez-le directement dans le milieu de placage pré-incubé et secouez doucement la plaque. 2 à 4 heures après l’ensemencement, vérifiez les plats de dressage au microscope optique. La majorité des neurones auraient dû être attachés à la lamelle.

À l’aide d’une pince à pointe fine, retournez les lamelles dans les boîtes d’alimentation de cellules gliales contenant un milieu de culture neuronal préconditionné avec le côté du point de cire vers le bas. Les neurones peuvent se développer dans les boîtes nourricières de cellules gliales jusqu’à un mois. Nourrissez les neurones tous les sept jours avec 1 millilitre de milieu de culture neuronal frais.