Génération d’une culture de neurones primaires de faible densité à partir de neurones embryonnaires congelés

Commencez avec un cryoflacon contenant des neurones embryonnaires cryoconservés et placez-le dans un bloc chauffant pour une décongélation contrôlée.

Ensuite, transférez les neurones décongelés dans un tube et diluez-les avec un milieu neurobasal goutte à goutte pour équilibrer la pression osmotique et prévenir la lyse cellulaire.

Cela génère une suspension homogène avec des neurones uniformément dispersés.

Ensemencez la suspension neurale diluée sur une plaque multi-puits enrobée de poly-L-lysine contenant un milieu neurobasal enrichi en nutriments et en antibiotiques.

Incuber pour permettre à la poly-L-lysine chargée positivement d’interagir avec les neurones via des interactions électrostatiques, facilitant ainsi leur adhésion.

Approvisionnez les puits avec des milieux neurobasaux frais.

Incuber les cellules dans le même milieu dans des conditions humides pour éviter l’évaporation du milieu.

Les neurones embryonnaires utilisent les nutriments et se développent en développant des processus neuronaux et en formant des neurones primaires.

Le milieu neurobasal maintient les neurones primaires qui apparaissent largement espacés, générant une culture primaire de faible densité avec des connexions neuronales.

Commencez par enduire une microplaque de 96 puits avec 100 microlitres de poly-L-lysine par puits. Ensuite, incubez les plaques pendant la nuit à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, retirez la solution de poly-L-lysine. Lavez les plaques deux fois avec de l’eau stérilisée et une fois avec un milieu de culture frais sans supplément. Faites sécher les plaques. Les assiettes sèches peuvent être emballées et stockées jusqu’à un mois à 4 degrés Celsius.

Pour commencer l’ensemencement cellulaire, ajoutez 50 microlitres de milieu de culture dans chaque puits de la plaque revêtue. Remplissez les puits périphériques avec 200 microlitres d’eau stérilisée et incubez la plaque pendant une heure à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.

Retirez le cryoflacon neuronal du réservoir d’azote liquide et placez-le dans un bloc de chaleur à 37 degrés Celsius pour décongeler partiellement son contenu. À l’aide d’une pipette de 1 millilitre avec une pointe à large calibre, transférez lentement le contenu du flacon goutte à goutte dans un tube stérile de 50 millilitres. Rincez le cryoflacon vide avec 1 millilitre de milieu de culture à température ambiante. Transférez la solution de rinçage dans le tube de 50 millilitres contenant la suspension cellulaire.

Ensuite, ajoutez 9 millilitres de milieu de culture à température ambiante dans le tube de 50 millilitres, ce qui porte le volume à 11 millilitres. Après avoir compté les cellules à l’aide d’un hémocytomètre, transférez la suspension cellulaire dans un réservoir. Maintenant, à l’aide d’une pipette multicanaux avec des pointes à large diamètre, distribuez la suspension cellulaire avec un comptage final de 1,0 x 10⁴ cellules par puits dans la plaque revêtue de 96 puits.

Incuber les neurones pendant 1 à 2 heures à 37 degrés Celsius sous 5 % de dioxyde de carbone. Remplacez ensuite le milieu de culture par 100 microlitres de milieu de culture préchauffé et incubez à nouveau dans les mêmes conditions.