Génération et différenciation de neurosphères primaires à partir de cellules souches neurales de poisson-zèbre

Commencer avec une plaque multipuits contenant un milieu de croissance enrichi en facteurs de croissance.

Ensemencez une suspension unicellulaire de cellules souches neurales de poisson-zèbre et incubez.

Initialement, les cellules souches utilisent les facteurs de croissance et prolifèrent.

Retirez les débris et ajoutez le milieu frais pour favoriser la prolifération cellulaire continue et l’agrégation spontanée pour former des neurosphères primaires flottantes libres.

Ensuite, transférez les neurosphères dans un puits frais contenant le milieu de croissance.

Incuber dans les mêmes conditions pour induire une expansion progressive des neurosphères.

Pipeter à plusieurs reprises pour dissocier mécaniquement les neurosphères en petits amas.

Ensuite, transférez-les sur une matrice extracellulaire bien enrobée, facilitant ainsi leur adhérence.

Remplacez le milieu de croissance par un milieu de différenciation sans facteur de croissance contenant de l’insuline.

L’absence de facteurs de croissance et la présence d’insuline stimulent la différenciation cellulaire en cellules gliales et en neurones avec des projections neuronales.

Pour vous préparer à la génération de la neurosphère, remplissez chaque puits d’une plaque de 24 puits avec 300 microlitres de milieu frais de condition Z. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de suspension cellulaire dans chaque puits, en les ensemenceant à une densité d’environ 500 cellules par microlitre. Ensuite, incubez la plaque à 30 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone.

Après une journée de culture, observez les cellules de la plaque à 24 puits au microscope. Attendez-vous à observer des suspensions unicellulaires à ce stade. Si des débris se sont accumulés au centre d’un puits, retirez-les en pipetant environ 100 microlitres de milieu et remplacez ce liquide par l’ajout de 100 microlitres de milieu frais à condition Z. Une fois que tous les débris ont été enlevés, incubez la plaque dans les conditions décrites précédemment.

Après une journée supplémentaire de culture, transférez 250 microlitres de suspension cellulaire d’un seul puits dans un nouveau puits vide. Répétez cette étape pour les 24 puits. Ensuite, ajoutez 250 microlitres de milieu frais à condition Z dans chaque puits et homogénéisez les suspensions en pipetant doucement de haut en bas. Incuber à nouveau les plaques dans les mêmes conditions et répéter cette procédure d’expansion après une journée supplémentaire de culture. Attendez-vous à observer une augmentation progressive de la taille des neurosphères les troisième et quatrième jours de cette période.

Pour commencer le passage, après quatre jours, retirez 250 microlitres de milieu, mais pas de neurosphères, de chaque puits. Ensuite, à l’aide d’une pipette de 1 millilitre, dissocier mécaniquement les neurosphères dans le volume moyen restant. Procéder à la mise en commun de la suspension cellulaire de chaque puits dissocié. Ensuite, comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et distribuez 250 microlitres de surnageant de culture primaire contenant 800 cellules par microlitre dans chaque puits d’une nouvelle plaque à 24 puits. Continuez en ajoutant 250 microlitres de milieu de condition Z dans chaque puits, puis en incubant la plaque comme décrit précédemment.