Une technique de co-culture indirecte neurone-astrocyte pour étudier les interactions neurones-glie

Commencez avec une plaque multipuits contenant un insert de membrane perméable recouvert de poly-D-lysine.

Ajoutez du milieu de croissance d’astrocytes dans le puits et ensemencez des astrocytes, une cellule gliale spécialisée, dans l’insert.

Incuber pour permettre l’adhérence cellulaire sur la poly-D-lysine via des interactions électrostatiques et former une monocouche.

Remplacez le milieu astrocytaire par un milieu de culture de neurones.

Transférez cet insert dans une plaque multipuits contenant des neurones embryonnaires primaires de souris collés sur une lamelle recouverte de polymère.

Incuber pour établir une co-culture indirecte neurones-astrocytes, où les deux types de cellules sont physiquement séparés mais partagent le même milieu de culture.

Les astrocytes sécrètent divers facteurs neurotrophiques essentiels à la survie et à la croissance des neurones.

Ces facteurs migrent à travers le support perméable et interagissent avec les neurones primaires. Cela favorise leur différenciation et forme des projections neuronales.

Ces projections allongent et établissent des connexions synaptiques entre les neurones, indiquant des interactions neurones-gliales.

Enduire chaque insert de 10 microgrammes par millilitre de poly-D-lysine et incuber pendant une heure. Au bout d’une heure, lavez les inserts deux fois avec du PBS.

Pendant ce temps, aspirez le milieu astrocytaire et lavez la culture une fois avec 10 millilitres de PBS pour vous assurer que le sérum résiduel est éliminé. Ensuite, ajoutez 3 millilitres de trypsine EDTA à 0,05 % dans les flacons et incubez les cellules pour la trypsinisation pendant environ 10 minutes. Ensuite, remettez doucement les cellules en suspension dans 7 millilitres de milieu astrocytaire.

Transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres et centrifugez pendant cinq minutes à 216 fois g. Ensuite, aspirez soigneusement le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 1 millilitre de milieu astrocytaire. Comptez les cellules à l’aide d’une chambre de comptage. Par la suite, remplissez la plaque de 24 puits avec 500 microlitres de milieu astrocytaire par puits. Aspirez le PBS et transférez 25 000 cellules dans 500 microlitres de milieu astrocytaire dans chaque insert individuel, et incubez la culture à 37 degrés Celsius.

Pour disséquer l’hippocampe, préparez trois plats de 10 centimètres remplis de milieu de préparation et un tube de 2 millilitres avec 1 millilitre de milieu de préparation. Disséquez l’hippocampe des fractions du cortex et recueillez-les dans un tube de 2 millilitres rempli de milieu de préparation.

Il est essentiel que l’hippocampe soit isolé sans aucun tissu adjacent à d’autres régions du SNC. Par conséquent, après l’ablation de l’hippocampe, les tissus contaminants étrangers doivent être éliminés en plus.

Après la dissection, transférez le tube sur un banc stérile à flux laminaire. Retirez soigneusement le milieu de préparation et digérez le tissu de l’hippocampe avec 1 millilitre de solution de digestion contenant de la papaïne. Après 15 minutes de digestion, prélevez délicatement la solution de digestion par aspiration douce à l’aide d’une pipette.

En raison de la grande sensibilité du neurone, il est essentiel de triturer soigneusement l’hippocampe afin d’éviter les bulles et d’obtenir l’intensité de trituration optimale.

Lavez l’hippocampe trois fois avec un milieu neuronal en ajoutant et en aspirant soigneusement 1 millilitre de milieu de culture frais par cycle de lavage. Après l’étape finale de lavage, triturez soigneusement le tissu dans 1 millilitre de milieu neuronal. Ensuite, comptez les cellules à l’aide d’une chambre de comptage. Plaquez 35 000 cellules dans 500 microlitres de milieu neuronal par puits de la plaque à 24 puits, et incubez les neurones à 37 degrés Celsius pendant une heure.

Maintenant, sortez de l’incubateur les inserts préparés, qui ont été ensemencés avec des monocouches d’astrocytes confluents. Remplacez le milieu en aspirant le milieu astrocytaire et en le remplaçant par 500 microlitres de milieu neuronal frais.

Ensuite, placez soigneusement les inserts avec les astrocytes dans les puits qui contiennent les cultures de neurones à l’aide d’une pince stérile. Par la suite, replacez la co-culture indirecte d’astrocytes de neurones résultante dans l’incubateur jusqu’aux expériences.