Isolement et culture de la microglie à partir de cerveaux de rats à l’aide de milieux sans sérum

Prenez un cerveau de rat perfusé. Coupez-le en petits morceaux.

Homogénéiser le tissu dans un tampon pour libérer les cellules, y compris la microglie.

Une fois que le tissu non digéré s’est déposé, prélevez les cellules contenant le surnageant et ajoutez un tampon de séparation de la myéline.

Mélangez le contenu et centrifugez pour séparer les cellules de la myéline et des débris. Enlever la couche de débris de myéline et le surnageant.

Remettre les cellules en suspension dans un tampon et pipeter pour séparer les amas.

Passez la suspension dans une passoire pour éliminer les agrégats cellulaires restants.

Transférez les cellules filtrées dans une plaque de culture recouverte d’anticorps monoclonaux spécifiques de la microglie. Incuber pour faciliter l’adhésion de la microglie.

Laver avec un tampon pour éliminer les cellules non adhérentes. Ajouter la trypsine et incuber pour détacher la microglie.

Retirez la trypsine.

Ajouter un média sans sérum. Incuber sur glace pour affaiblir les interactions cellule-substrat.

Pipeter et recueillir la suspension dans un tube. Centrifugez et retirez le surnageant.

Remettre la microglie en suspension dans un milieu sans sérum et transférer sur une plaque multipuits recouverte de collagène. Incuber pour faciliter l’adhésion de la microglie.

Ajouter un milieu contenant des facteurs de croissance et des lipides. Incuber pour la maturation de la microglie.

Une fois que les cerveaux ont été collectés dans du DPBS froid, coupez chaque cerveau en morceaux d’un millimètre cube dans une boîte de Pétri sur de la glace avec une lame de scalpel froide, et transférez-les dans un homogénéisateur Dounce glacé avec 5 à 7 millilitres de tampon de douncing glacé. Ensuite, utilisez un homogénéisateur Dounce mal ajusté pour dissocier le tissu en 10 à 20 mouvements doux et incomplets. Veillez à ne pas écraser directement le tissu au fond de l’homogénéisateur. Au lieu de cela, poussez le tissu à travers l’espace entre les côtés du piston et l’homogénéisateur.

Il est important d’homogénéiser lentement le tissu avec plusieurs cycles de gonflement pour préserver la viabilité de la microglie.

Ensuite, retirez délicatement le piston pour éviter d’introduire des bulles d’air. Laissez les morceaux de tissu mal dissociés se déposer au fond de l’homogénéisateur et transférez le surnageant dans un nouveau tube conique réfrigéré de 50 millilitres. Par la suite, remplacez le volume retiré par un tampon de dounage frais et répétez la procédure de dissociation pendant un total de trois à quatre tours, ou jusqu’à ce que tous les tissus aient été dissociés.

Dans cette procédure, ajoutez un tampon de douncing glacé au tube conique de 50 millilitres contenant la suspension cellulaire et ajustez le volume total à 33,5 millilitres. Ensuite, ajoutez 10 millilitres de MSB à la suspension cellulaire et mélangez soigneusement en inversant le tube plusieurs fois. Cela se traduira par une concentration finale de 23 % de MSB dans un volume de 43,5 millilitres.

Après cela, centrifugez les cellules pendant 15 minutes à 500 g à 4 degrés Celsius avec freinage lent. Ensuite, retirez la couche supérieure de myéline, les débris et le surnageant à l’aide d’une pipette. Lorsque vous retirez la couche supérieure, veillez à ce qu’elle soit enlevée autant que possible.

Ensuite, remettez en suspension la pastille de cellule dans 12 millilitres de tampon de casserole. Triturez doucement la suspension cellulaire pour briser les amas de cellules restants. Dans cette étape, passez la suspension cellulaire dans une crépine de cellule de 70 micromètres pour éliminer les gros débris ou les amas de cellules. Rincez trois fois le plat de cuisson revêtu d’OX42 avec du DPBS. Ne laissez pas la plaque sécher complètement entre les lavages.

Videz le dernier lavage DPBS et appliquez la suspension cellulaire filtrée sur le plat de cuisson. Faites tourner doucement la plaque pour répartir les cellules. Ensuite, incubez la plaque sur une surface plane à température ambiante pendant 20 minutes pour permettre aux cellules d’adhérer. N’incubez pas plus de 20 minutes, sinon les cellules deviendront très difficiles à récupérer de la boîte. Ensuite, rincez 10 fois le plat de cuisson avec du DPBS pour éliminer les cellules non adhérentes.

La microglie sera fermement attachée à la plaque, alors faites tourner la plaque à chaque rinçage pour assurer l’élimination des autres cellules non adhérentes. Videz le dernier lavage DPBS et remplacez-le par 15 millilitres de DPBS et 200 microlitres de trypsine.

Pour trypsiniser les cellules, incubez la boîte pendant moins de 10 minutes ou égale à 37 degrés Celsius. Après 10 minutes de trypsinisation, la microglie sera toujours collée à la plaque. Versez le mélange et lavez doucement la plaque deux fois avec du DPBS pour éliminer la trypsine. Ensuite, remplacez par 12 millilitres de MGM glacé.

Par la suite, placez la coupelle sur de la glace pendant deux minutes pour aider à affaiblir l’interaction entre les cellules et le substrat, et assurez-vous que la parabole est plate pour éviter que les zones de la coupelle ne se dessèchent. Ensuite, pipetez vigoureusement avec une pipette de 10 millilitres et un contrôleur de pipette à grande vitesse pour récupérer les cellules de la boîte de cuisson. Dessinez une grille de 16 x 16 avec le jet de liquide de la pipette pour essayer de retirer toutes les cellules.

Il est important de trouver un équilibre entre la récupération cellulaire globale et la santé de votre culture. Le pipetage répété d’un surnageant cellulaire contre la boîte de cuisson entraînera une réduction de la viabilité de votre culture.

Vérifiez les cellules au microscope à un grossissement de 20x pour vous assurer qu’elles se sont détachées de la plaque. Marquez les endroits sur le dessus de la parabole où les cellules sont coincées et répétez le pipetage dans ces zones. Prélever la suspension cellulaire et aliquote 3 à 4 millilitres de surnageant dans chaque tube conique de 15 millilitres. Faites-le tourner pendant 15 minutes à 500 g à 4 degrés Celsius avec freinage lent.

Après 15 minutes, aspirez le surnageant, en laissant 0,5 millilitre de MGM avec la pastille cellulaire. Ensuite, mettez chaque pastille en suspension dans le MGM restant et regroupez les cellules de tous les tubes. Ensuite, comptez les cellules avec l’hémocytomètre.

Maintenant, plaquez 15 microlitres de collagène IV directement au centre d’une plaque de culture tissulaire anionique à revêtement cationique de 24 puits, et incubez pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius. Après avoir compté les cellules à l’aide d’un hémocytomètre, diluez-les à 2,3 x ^10-5 par millilitre de MGM. Aspirez le collagène IV et plaquez immédiatement 15 microlitres de suspension cellulaire à cet endroit pour obtenir 3,5 x 10³ cellules par point.

Ensuite, incubez pendant cinq à dix minutes à 37 degrés Celsius pour permettre aux cellules d’adhérer. Ensuite, ajoutez doucement 500 microlitres de TIC équilibré en CO₂ dans le puits.