Élimination sélective de la microglie d’une culture de neurones granulaires cérébelleux de rat

Prenez un cervelet de rat récolté et coupez-le en morceaux.

Transférez les fragments dans un tube contenant de la trypsine et incuberez.

La trypsine digère la matrice extracellulaire du tissu, desserrant les neurones granulaires cérébelleux, ainsi que les cellules non neuronales telles que la microglie et les astrocytes.

Ajoutez un tampon contenant un inhibiteur de la trypsine et de la DNase. L’inhibiteur inactive la trypsine tandis que la DNase dégrade l’ADN contaminant.

Centrifugez et jetez le surnageant.

Remettre le tissu en suspension dans un tampon contenant l’inhibiteur et la DNase, et le dissocier mécaniquement pour former une suspension unicellulaire.

Superposez la suspension sur une solution tampon contenant des protéines.

Centrifugez et jetez le surnageant contenant les débris cellulaires.

Remettre les cellules en suspension dans le milieu et les ensemencer sur des lamelles enrobées de poly-L-lysine pour faciliter la fixation cellulaire.

Retirez le support. Lavez les cellules avec un milieu frais, puis ajoutez un milieu contenant un inhibiteur du cycle cellulaire pour prévenir la prolifération des cellules gliales.

Remplacez la moitié du milieu par un milieu frais contenant un inhibiteur de lysosome.

L’inhibiteur cible sélectivement la microglie et perturbe les membranes lysosomales, provoquant la mort microgliale et son retrait de la culture.

Commencez cette procédure en prélevant le cervelet de ratons âgés de quatre à sept jours. Placez-les immédiatement dans une boîte de Pétri contenant cinq millilitres de solution A sur glace. Ensuite, retirez l’excès de solution du cervelet et placez le tissu dans le couvercle de la boîte de Pétri. Ensuite, hachez finement le tissu avec une lame de rasoir bien flammée dans au moins trois directions différentes.

Ensuite, ajoutez le mouchoir haché à la solution B. Placez-le dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes et secouez-le doucement toutes les deux minutes. Ensuite, ajoutez 20 millilitres de solution D dans le tube pour neutraliser la trypsine. Agiter et centrifuger à 65 g pendant cinq minutes. Ensuite, versez le surnageant. Remettez-le en suspension dans quatre millilitres de solution C.

Triturez l’échantillon 10 fois avec chacune des trois pipettes en verre flammé de diamètre décroissant jusqu’à ce que la suspension soit aussi homogène que possible. Ensuite, ajoutez lentement et doucement quelques gouttes de cet homogénat sur le BSA-EBSS. S’il commence à couler à travers le BSA-EBSS, triturez davantage et ajoutez un peu plus de solution C. L’homogénat doit reposer en une couche sur le BSA-EBSS.

Essorez-le à 100 g pendant cinq minutes et ne secouez pas. Ensuite, retirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans un millilitre de milieu MEM. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et plaquez-les à 800 000 cellules par lamelle dans 500 microlitres de milieu MEM. Après cela, placez-les dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 6 % de dioxyde de carbone. Ensuite, préparez une solution de milieu MEM contenant 10 micromolaires de l’inhibiteur du cycle cellulaire, AraC.

Pour chaque lamelle, conservez 250 microlitres de l’ancien milieu dans une plaque fraîche à 24 puits et aspirez le reste. Ajoutez 250 microlitres de milieu MEM normal pour laver les cellules. Par la suite, ajoutez 250 microlitres de vieux milieu dans les cellules et complétez avec 250 microlitres de milieu contenant AraC.

Dans cette procédure, ajoutez du LME pur à cinq millilitres de milieu MEM pour obtenir une concentration finale de 150 millimolaires de LME. Ramener la solution à pH 7,4 en utilisant une solution acide-base. Ensuite, filtrez-le stérilement à l’aide d’un PES de 28 millimètres avec un filtre à seringue de 0,2 micromètre.

Ensuite, diluez la solution LME à une concentration de 50 millimolaires dans un milieu MEM. Ensuite, placez-le dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes, avec un milieu MEM normal pour les cultures témoins. Après 10 minutes, retirez 250 microlitres de milieu MEM de chaque culture CGC. Ensuite, maintenez le support à 37 degrés Celsius.

Ensuite, traitez les cellules avec un milieu MEM contenant deux fois de LME ou avec un milieu MEM préchauffé sans LME pour les cultures témoins. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée avec 6 % de dioxyde de carbone pendant une heure. Ensuite, lavez les cellules deux fois dans un milieu MEM frais et préchauffé pour éliminer le milieu contenant du LME.

Ensuite, remplacez le milieu de culture conservé par une quantité égale de milieu MEM frais préchauffé. Enfin, incubez les cultures dans du dioxyde de carbone humidifié à 6 % à 37 degrés Celsius.