Name: Lempreinte génétique des Mycobacterium leprae Souches à laide variable Tandem Repeat Nombre (VNTR) - Analyse de la longueur des fragments (FLA) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Découvrez la méthode d'empreinte génétique par VNTR pour Mycobacterium leprae à partir de biopsies cliniques. Cette technique de PCR multiplex et d'électrophorèse capillaire permet de tracer la transmission de la lèpre.

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Le financement a été fourni par le NIH / NIAID octroi RO1-AI-63457 et de l&#39;ARRA subventions complément RO1-AI-63457 S1. Nous reconnaissons les contributions de tous les membres actuels et passés du groupe de laboratoires et des collaborateurs.

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</ol>

La collecte d&#39;échantillons de peau de patients lépreux nécessite cliniciens qualifiés ou techniciens travaillant dans des cliniques de peau. Les travailleurs de laboratoire manipulant ces échantillons doit prendre grand soin de porter des blouses de laboratoire, des gants et des lunettes de protection et de travailler dans un cabinet de bio-sécurité lors de la manipulation des échantillons de tissus humains infectés ou tatou. Désinfection des surfaces et des outils est également critique. Travailler dans un endroit propre, stérile de bio-sécurité armoire est important pour éviter la contamination des échantillons d&#39;ADN. Extraction de l&#39;ADN est devenu relativement facile grâce au développement de kits d&#39;extraction d&#39;entreprises telles que Qiagen. Des directives doivent être suivies attentivement. Tous les échantillons doivent être conservés au froid lorsqu&#39;il n&#39;est pas utilisé. Évitez répétées, des changements de température extrêmes pour les échantillons. Amorces d&#39;ADN utilisées dans ce travail peut être commandé auprès de diverses entreprises qui ont été cités dans la liste des références bibliographiques à la fin du présent document. Il faut prendre soin de travailler avec des amorces dans un environnement de l&#39;ADN libre, afin d&#39;éviter toute contamination. Primaires viennent sous forme de poudre sèche et doit être mélangé avec TE et dilué à une concentration 100 microns, puis séparés en petites quantités (figure 2a). Les solutions de travail des amorces sont encore dilués à des concentrations 10 uM. Encore une fois, ne pas utiliser des échantillons d&#39;ADN dans les zones / hottes où l&#39;on utilise des amorces et préparés. Les produits de PCR doivent également être conservés au froid lorsqu&#39;il n&#39;est pas utilisé. Un gel d&#39;agarose 3% la préparation donnera une meilleure séparation bande d&#39;ADN, mais prend plus de temps à courir. Pour des raisons purement qualitative, 2% est généralement suffisant. Solution de bromure d&#39;éthidium utilisé pour la coloration de l&#39;ADN dans les gels d&#39;agarose est une génotoxine très actif qui est absorbé par la peau. Manipuler cette solution et les gels colorés avec de l&#39;utiliser le plus grand soin et toujours en étant sûr de porter des gants. Laver soigneusement les mains après avoir manipulé des échantillons d&#39;ADN ou de matériaux de bromure d&#39;éthidium. Eliminer la solution une coloration au bromure d&#39;éthidium, les laver et les gels selon les directives institutionnelles. Les gels sont pas systématiquement requis; cette étape peut être éliminé une fois les méthodes FLA ont été établis. Il est temps et consommer réactif. La solution de formamide utilisées dans la préparation des échantillons pour FLA est également très toxique et doit être manipulé avec soin. Se laver les mains après son utilisation. Débarrassez-vous de la suite des directives institutionnelles. Lecture des résultats du FLA en utilisant le logiciel du scanner de pointe peuvent être difficiles. Un ensemble de base des appels allèle (nombre de répétitions en tandem) a été développée au CSU (tableaux 4-7). (Il convient de noter que tableaux 4-7 peut-être pas tout compris. Comme d&#39;autres souches de M. leprae sont étudiés, avec des allèles nombre de copies en dehors des plages inscrites peuvent être trouvés.) Un défi particulier consiste à &quot;bégayer&quot; pics. Ce sont des familles de pics, en particulier des déclarations de soupçon qui n&#39;impliquent que deux à trois répétitions de paires de bases, telles que (TA) 10. Parfois, la sélection des pics corriger à lire est difficile (figure 7). Dans cette figure, le pic dans le contrôle positif à 190 pb est le pic principal. Inférieure Peaks en hauteur qui sont 2, 4 ou même 6 paires de base plus grande ou plus petite que le pic principal sont appelés «pics bégaiement.&quot; A-tailing peut aussi causer de la confusion. A-tailing est décrit plus haut dans le texte et la figure 8. Enfin, si les produits de PCR sont très abondants dans les échantillons, les pics peuvent apparaître avec un pic double. Dans ce cas, lisez le centre de la forme de pointe. (Voir Figure 6, Patient 6.) La gestion des données peut être une tâche redoutable pour ce type de travail. Il est important d&#39;enregistrer toutes les informations pertinentes pour toutes les expériences telles que: la date d&#39;une tâche ou une procédure, l&#39;opérateur, bandes / plaques cartes, des ordres FLA, des conditions de PCR et les recettes, les dates des gels et des photographies, des températures de stockage, des dilutions matrice d&#39;ADN, FLA électroniques lieux de stockage de fichiers, organisation, etc Bonne gestion des données et peut sauver des heures de temps passé à chercher des éléments d&#39;information dans le futur. Le travail de laboratoire décrit ici a été en cours depuis plusieurs années à la Colorado State University et à d&#39;autres endroits dans le monde. La grande photo de ce que l&#39;ensemble des données recueillies signifie et comment elle peut être d&#39;un usage futur commence à émerger. Figures 10A et 10B montrent comment ces empreintes d&#39;ADN peuvent être utilisés pour distinguer les différentes M. leprae tensions entre les pays (10A), ou même entre les familles (10B). Cas de la famille et la communauté liée a été démontré pour mener M. leprae d&#39;similaires ou identiques types de souches VNTR. L&#39;espoir est que cela peut être possible d&#39;avoir un aperçu plus loin dans le mode (s) de transmission de la lèpre afin qu&#39;un système de détection précoce des réseaux de transmission peuvent être développés pour ces mos de personnest à risque, et que la pharmacothérapie curative peut commencer avant des dommages neurologiques permanents et dermatologiques est fait.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> Sang DNeasy et Kit de tissus </td><td> Qiagen </td><td> 69504 </td><td></td></tr><tr><td> Multiplex PCR Kit </td><td> Qiagen </td><td> 206143 </td><td></td></tr><tr><td> DNA Primers </td><td> Divers </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gel d&#39;agarose </td><td> Divers </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5x ou 6x tampon de chargement de gel </td><td> New England Biolabs </td><td> B7021S </td><td> Recettes disponibles pour rendre votre propre * </td></tr><tr><td> Solution de bromure d&#39;éthidium </td><td> Divers </td><td></td><td> Diluer du con. </td></tr><tr><td> Salut-Di Formamide Solution </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4311320 </td><td></td></tr><tr><td> Gene scan -500 LIZ </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4322682 </td><td></td></tr></tbody></table> <a href="http://biowww.net/buffer-reagent/6X-Gel-loading-buffer-bromophenol-blue-sucrose.html">* Http://biowww.net/buffer-reagent/6X-Gel-loading-buffer-bromophenol-blue-sucrose.html</a> <table border="1"><tbody><tr><th> Équipement </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> 2 Réfrigérateurs </td><td> 4 ° C: 1 pour les échantillons d&#39;ADN, une pour les amorces et les réactifs Multiplex </td></tr><tr><td> 1 four micro-ondes </td><td> Ou de façon appropriée pour le chauffage et l&#39;eau d&#39;agarose pour faire des gels </td></tr><tr><td> 1 autoclave </td><td> Autocuiseur ou pour stériliser des matériaux </td></tr><tr><td> Machine à PCR </td><td> Thermocycleur </td></tr><tr><td> 2 jeux de pipettes </td><td> 0,5 à 10 ul, 10-100 ul, 20-200 ul, 1000 ul 1 jeu pour les apprêts, 1 jeu de l&#39;ADN </td></tr><tr><td> Submarine boîte électrophorèse sur gel </td><td> Avec des formes et des peignes pour les gels préparation. </td></tr><tr><td> Alimentation d&#39;électrophorèse </td><td> Avec des câbles pour la connexion à la boîte de gel </td></tr><tr><td> Bloc de chaleur </td><td> Pour tubes Eppendorf </td></tr><tr><td> Centrifugeuse </td><td> Pour les tubes Eppendorf / bandes </td></tr><tr><td> Système d&#39;électrophorèse capillaire (analyseur génétique) </td><td> Ou l&#39;accès à une institution qui peut effectuer cette analyse </td></tr><tr><td> Plastiques </td><td> Jetable d&#39;aérosol de pipette, tubes Eppendorf, des bandes de 8 puits, des plaques de 96 puits, dont certains de qualité optique </td></tr><tr><td> Un ordinateur avec connexion Internet </td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;empreinte génétique des mycobacterium leprae souches à l&#39;aide variable tandem repeat nombre (vntr) - analyse de la longueur des fragments (fla)

DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Length Analysis (FLA)

L&#39;étude de la transmission de la lèpre est particulièrement difficile car l&#39;agent causal, Mycobacterium leprae, ne peuvent pas être cultivées en laboratoire. Les seules sources de la bactérie sont malades de la lèpre et de tatous infectés expérimentalement et des souris nude. Ainsi, de nombreuses méthodes utilisées en épidémiologie moderne ne sont pas disponibles pour l&#39;étude de la lèpre. Malgré un vaste programme mondial de la drogue traitement de la lèpre en œuvre par l&#39;OMS une, la lèpre reste endémique dans de nombreux pays, avec environ 250 000 nouveaux cas chaque année. 2 L&#39;ensemble de M. leprae génome a été cartographié 3,4 et de nombreux locus ont été identifiés qui ont répété les segments de deux ou plusieurs paires de bases (appelés micro et minisatellites). 5 souches cliniques de M. leprae peut varier dans le nombre de segments répétés en tandem (courtes répétitions en tandem, STR) à plusieurs de ces loci. 5,6,7 répéter en tandem en nombre variable (VNTR) 5 analyse a été utilisée pour distinguer les différentes souches du bacille de la lèpre. Certains des loci semblent être plus stables que d&#39;autres, montrant moins de variation dans le nombre le répète, tandis que d&#39;autres semblent évoluer plus rapidement, parfois chez le même patient. Alors que la variabilité de certains VNTR a soulevé des questions quant à leur aptitude à 7,8,9 typage des souches, les nouvelles données indiquent que l&#39;analyse de loci multiples, qui sont diversifiés dans leur stabilité, peut être utilisé comme un outil précieux épidémiologiques. Plusieurs locus VNTR analyse (MLVA) 10 a été utilisé pour étudier l&#39;évolution de la lèpre et la transmission dans plusieurs pays dont la Chine 11,12, au Malawi 8, les Philippines 10,13, et le Brésil 14. MLVA implique plusieurs étapes. Tout d&#39;abord, l&#39;ADN bactérien est extrait avec l&#39;ADN du tissu hôte à partir de biopsies cliniques ou frottis fente (SSS). 10 Le locus désiré sont ensuite amplifiés de l&#39;ADN extrait par réaction en chaîne de polymérase (PCR). Amorces marqués à la fluorescence pour 4-5 loci différents sont utilisés par réaction, avec 18 loci étant amplifié dans un total de quatre réactions. 10 Les produits de PCR peut être soumis à une électrophorèse sur gel d&#39;agarose pour vérifier la présence des segments d&#39;ADN désirée, puis soumis à une analyse de longueur des fragments fluorescents (FLA) par électrophorèse capillaire. ADN de bactéries de tatou passages avec un nombre connu de copies répéter pour chaque locus est utilisé comme contrôle positif. Les chromatogrammes FLA sont ensuite examinés en utilisant le logiciel du scanner Peak et de longueur des fragments est converti en nombre de copies VNTR (allèle). Enfin, les haplotypes VNTR sont analysés pour les modèles, et lorsqu&#39;ils sont combinés avec les données cliniques des patients peuvent être utilisés pour suivre la distribution des types de souches.

La lèpre, causée par<em&gt; Mycobacterium leprae</em&gt;, Est encore endémique dans de nombreux endroits. Afin d&#39;en apprendre davantage sur la propagation et le mode de transmission de la lèpre, il est important de déterminer quelle souche de<em&gt; M. leprae</em&gt; A infecté un patient. Nombre variable de répétitions en tandem (VNTR) frappe est un tel procédé.

L&#39;empreinte génétique des Mycobacterium leprae Souches à l&#39;aide variable Tandem Repeat Nombre (VNTR) - Analyse de la longueur des fragments (FLA)

L'étude de la transmission de la lèpre est particulièrement difficile car l'agent causal, Mycobacterium leprae, ne peut être cultivé en laboratoire.

L'objectif général de cette procédure est d'élaborer un profilage génétique distinctif de Mycobacterium leprae, la bactérie non cultivable responsable de la lèpre, directement à partir de prélèvements cliniques. L'ADN bactérien de M. leprae, extrait de biopsies de patients, est amplifié par une PCR multiplex utilisant des amorces fluorescentes spécifiques des régions répétées en tandem à nombre variable, ou VNTR. Une fois l'ADN amplifié, une électrophorèse capillaire est réalisée afin d'analyser la longueur des fragments.Les données sont analysées afin de déterminer le nombre de segments d'ADN correspondant à des répétitions courtes en tandem à chaque locus. Étant donné que différentes souches d'EPRI présentent un nombre variable de répétitions en tandem à chaque locus, les données provenant de plusieurs locus permettent d'obtenir des empreintes génétiques uniques, et une base de données des types de souches des patients peut être établie à l'aide de cette technique.La structure des populations, l'évolution et la transmission de la lèpre entre les patients au sein de communautés définies et à l'échelle mondiale peuvent être caractérisées, fournissant ainsi des outils génétiques et des preuves pour l'élimination de la lèpre. Cette méthode peut être utilisée pour suivre la propagation de la lèpre, identifier des regroupements d'infections récentes et les individus à risque, ainsi que mesurer l'efficacité des programmes de contrôle. La procédure sera démontrée par Lee et Ron Jensen, chercheurs de mon laboratoire, et Jason Rivers, issu de notre plateforme instrumentale. Extrayez l'ADN à partir de biopsies cliniques en utilisant un kit standard d'extraction d'ADN KaiGen.Une fois l'ADN obtenu, préparez un nouvel espace de travail à l'intérieur d'un cabinet PCR propre. Pour éviter toute contamination par l'ADN, nettoyez le cabinet et un ensemble de pipettes avec de l'éthanol à 70 % et exposez le cabinet et les pipettes à la lumière UV pendant 15 minutes. Une fois le cabinet propre, la PCR multiplex peut être préparée pour chaque réaction : quatre à cinq paires d'amorces, dont une amorce par paire est marquée de manière fluorescente.Doit être mélangé. Utilisez des stocks de primers à 10 micromolaire préparés dans du tampon TE pour préparer les mélanges de primers ; mélangez des quantités égales de tous les primers directs ou supérieurs dans un tube Eppendorf afin d'obtenir une concentration finale de deux micromolaire. Pour chaque primer, ajoutez du tampon TE si nécessaire.Dans un autre tube Eppendorf, mélangez de la même manière tous les amorces reverse ou inférieures. Une fois les mélanges d'amorces préparés, préparez le mélange PCR MES. Élaborez une carte de plaque étiquetée avec tous les échantillons et les témoins par échantillon.Le mélange maître doit contenir 12 microlitres du mélange de PCR multiplex KaiGen, deux microlitres de chaque pool d'amorces et deux microlitres de solution Q. Veillez à préparer suffisamment de mélange maître pour inclure les contrôles et tenir compte des pertes lors du pipetage. Centrifuger brièvement le mélange maître.Ensuite, aliquoter 18 microlitres de mélange maître dans chaque puits d'une plaque PCR. Pour éviter de contaminer les échantillons d'ADN, changer les gants, nettoyer et désinfecter une hotte de sécurité biologique distincte. Comme précédemment, une fois la hotte décontaminée, transférer la plaque dans cette hotte.Ensuite, ajoutez deux microlitres d'échantillon d'ADN dans chaque puits contenant le mélange maître. Veillez à utiliser des pointes de pipette antiaérosol pour éviter toute contamination croisée. Scellez soigneusement les plaques PCR et effectuez une courte centrifugation pour mélanger les contenus.Ensuite, placer la plaque de réaction dans le thermocycleur et démarrer le programme de PCR pour soumettre les échantillons. Pour la FLA, préparer la taille en forme d'amide, le mélange maître, et ajouter les produits de PCR dilués dans un tube einor propre combiné à 12 microlitres de solution d'amide haut débit et 0,3 microlitre de standard de taille gene scan 500 lid par échantillon à tester. Répartir 12,3 microlitres de cette solution par puits dans une plaque de réaction optique de 96 puits.Une fois la PCR terminée, la plaque est centrifugée. Veillez à ce que la position de chaque échantillon soit enregistrée sur la carte de la plaque. Ensuite, dans une autre plaque de 96 puits, aliquotez 59 microlitres d'eau sans nucléase par puits et ajoutez un microlitre de chaque réaction de PCR par puits afin de diluer l'ADN amplifié au ratio de un à soixante.Une fois l'ADN dilué, utilisez une pipette multicanal pour transférer un microlitre de chaque échantillon PCR dilué dans le puits correspondant de la plaque contenant la solution libre de formamide. Une fois le programme terminé, les échantillons peuvent être analysés par électrophorèse standard sur gel d'agarose afin de confirmer que les fragments d'ADN de tailles prédites ont été amplifiés à ce stade. Les échantillons sont préparés pour l'analyse par électrophorèse capillaire fluorescente à l'aide d'un analyseur génétique FLA ; avant l'analyse, ajoutez un septum sur la plaque et centrifugez brièvement pour éliminer les bulles d'air et faire descendre l'échantillon au fond des puits.L'IDE va dénaturer chimiquement les brins, il n'est donc pas nécessaire de procéder à une dénaturation thermique. Placer la plaque dans un plateau de chargement. Évaluer le produit de PCR marqué par électrophorèse capillaire, par exemple à l'aide de l'analyseur génétique ABBI'S 3130 xl.Analyser les échantillons à l’aide d’un capillaire de 50 centimètres rempli de polymère POP7 servant de milieu de séparation. L’ADN migre vers l’extrémité du capillaire où un laser et un détecteur mesurent les marqueurs fluorescents ; ouvrez le logiciel de collecte de l’analyseur. L’analyseur doit être étalonné pour détecter tous les colorants utilisés avant l’analyse des échantillons, y compris l’étalon de taille. L’étalon utilisé pour ces échantillons est le G5 d’ABI. Injectez électrocinétiquement les échantillons à 1,6 kilovolt pendant 15 secondes.Séparez les fragments en appliquant 15 kilovolts pendant 1800 secondes. La durée totale de chaque analyse est d'environ 45 minutes. Une fois l'analyse terminée, créez des fichiers de données pour chaque échantillon.Les fichiers sont placés dans un dossier de plaque par le logiciel de collecte de l'analyseur à un emplacement prédéterminé. Les fichiers sont au format FSA. Les données FLA peuvent être analysées à l'aide d'un logiciel de lecture de pics, disponible gratuitement sur le site web d'Applied Biosystems.Pour analyser les données, cliquez sur démarrer un nouveau projet, puis sur ajouter des fichiers. Chargez les fichiers de données sélectionnés dans le programme, y compris les contrôles positifs et négatifs. Sélectionnez et analysez les fichiers chargés.Les résultats sont représentés sous forme de chromatogramme FLA. Les étalons de taille apparaissent sous forme de pics orange, tandis que les pics colorés représentent les échantillons d'ADN bactérien pour chaque locus analysé dans l'échantillon ; cliquez sur un pic pour déterminer sa taille en paires de bases. En raison de la synthèse par glissement du brin par la polymérase ADN, une famille de pics de la même couleur sera détectée pour certains locus de microsatellites.Dans ces cas, le pic sélectionné est généralement celui d'amplitude maximale. Comparez les tailles des fragments dans chaque échantillon à la taille du témoin positif afin de déterminer le nombre de segments répétés en tandem présents pour chaque allèle testé, puis enregistrez les données dans un tableur Excel pour une analyse ultérieure. Sur cette figure, les empreintes génétiques d'isolats provenant de sept patients appartenant à trois familles différentes d'un même village sont présentées, et le nombre de répétitions en tandem pour chaque locus polymorphe analysé est indiqué.Ces données suggèrent que deux membres de la famille B sont infectés par la même souche, tandis qu'un membre est infecté par une souche distincte. Les membres des familles C sont probablement infectés par la même souche. Tout comme les membres de la famille A. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'inclure systématiquement la PCR multiplex et l'analyse de la longueur des fragments afin d'obtenir des empreintes ADN V-N-T-R pour les patients atteints de lèpre se présentant en consultation.Ces outils moléculaires novateurs viennent compléter l'épidémiologie conventionnelle dans le cadre de la lutte contre la lèpre.

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Réaction en chaîne par polymérase et hybridation par transfert de points pour la détection de leptospires dans des échantillons d’eau

Découvrez la méthode d'empreinte génétique par VNTR pour Mycobacterium leprae à partir de biopsies cliniques. Cette technique de PCR multiplex et d'électrophorèse capillaire permet de tracer la transmission de la lèpre.

Lempreinte génétique des Mycobacterium leprae Souches à laide variable Tandem Repeat Nombre (VNTR) - Analyse de la longueur des fragments (FLA) (Vidéo) | JoVE Journal

L'empreinte génétique des Mycobacterium leprae Souches à l'aide variable Tandem Repeat Nombre (VNTR) - Analyse de la longueur des fragments (FLA)

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