L'empreinte génétique des Mycobacterium leprae Souches à l'aide variable Tandem Repeat Nombre (VNTR) - Analyse de la longueur des fragments (FLA)

L'objectif général de cette procédure est d'élaborer un profilage génétique distinctif de Mycobacterium leprae, la bactérie non cultivable responsable de la lèpre, directement à partir de prélèvements cliniques. L'ADN bactérien de M. leprae, extrait de biopsies de patients, est amplifié par une PCR multiplex utilisant des amorces fluorescentes spécifiques des régions répétées en tandem à nombre variable, ou VNTR. Une fois l'ADN amplifié, une électrophorèse capillaire est réalisée afin d'analyser la longueur des fragments.

Les données sont analysées afin de déterminer le nombre de segments d'ADN correspondant à des répétitions courtes en tandem à chaque locus. Étant donné que différentes souches d'EPRI présentent un nombre variable de répétitions en tandem à chaque locus, les données provenant de plusieurs locus permettent d'obtenir des empreintes génétiques uniques, et une base de données des types de souches des patients peut être établie à l'aide de cette technique.

La structure des populations, l'évolution et la transmission de la lèpre entre les patients au sein de communautés définies et à l'échelle mondiale peuvent être caractérisées, fournissant ainsi des outils génétiques et des preuves pour l'élimination de la lèpre. Cette méthode peut être utilisée pour suivre la propagation de la lèpre, identifier des regroupements d'infections récentes et les individus à risque, ainsi que mesurer l'efficacité des programmes de contrôle. La procédure sera démontrée par Lee et Ron Jensen, chercheurs de mon laboratoire, et Jason Rivers, issu de notre plateforme instrumentale. Extrayez l'ADN à partir de biopsies cliniques en utilisant un kit standard d'extraction d'ADN KaiGen.

Une fois l'ADN obtenu, préparez un nouvel espace de travail à l'intérieur d'un cabinet PCR propre. Pour éviter toute contamination par l'ADN, nettoyez le cabinet et un ensemble de pipettes avec de l'éthanol à 70 % et exposez le cabinet et les pipettes à la lumière UV pendant 15 minutes. Une fois le cabinet propre, la PCR multiplex peut être préparée pour chaque réaction : quatre à cinq paires d'amorces, dont une amorce par paire est marquée de manière fluorescente.

Doit être mélangé. Utilisez des stocks de primers à 10 micromolaire préparés dans du tampon TE pour préparer les mélanges de primers ; mélangez des quantités égales de tous les primers directs ou supérieurs dans un tube Eppendorf afin d'obtenir une concentration finale de deux micromolaire. Pour chaque primer, ajoutez du tampon TE si nécessaire.

Dans un autre tube Eppendorf, mélangez de la même manière tous les amorces reverse ou inférieures. Une fois les mélanges d'amorces préparés, préparez le mélange PCR MES. Élaborez une carte de plaque étiquetée avec tous les échantillons et les témoins par échantillon.

Le mélange maître doit contenir 12 microlitres du mélange de PCR multiplex KaiGen, deux microlitres de chaque pool d'amorces et deux microlitres de solution Q. Veillez à préparer suffisamment de mélange maître pour inclure les contrôles et tenir compte des pertes lors du pipetage. Centrifuger brièvement le mélange maître.

Ensuite, aliquoter 18 microlitres de mélange maître dans chaque puits d'une plaque PCR. Pour éviter de contaminer les échantillons d'ADN, changer les gants, nettoyer et désinfecter une hotte de sécurité biologique distincte. Comme précédemment, une fois la hotte décontaminée, transférer la plaque dans cette hotte.

Ensuite, ajoutez deux microlitres d'échantillon d'ADN dans chaque puits contenant le mélange maître. Veillez à utiliser des pointes de pipette antiaérosol pour éviter toute contamination croisée. Scellez soigneusement les plaques PCR et effectuez une courte centrifugation pour mélanger les contenus.

Ensuite, placer la plaque de réaction dans le thermocycleur et démarrer le programme de PCR pour soumettre les échantillons. Pour la FLA, préparer la taille en forme d'amide, le mélange maître, et ajouter les produits de PCR dilués dans un tube einor propre combiné à 12 microlitres de solution d'amide haut débit et 0,3 microlitre de standard de taille gene scan 500 lid par échantillon à tester. Répartir 12,3 microlitres de cette solution par puits dans une plaque de réaction optique de 96 puits.

Une fois la PCR terminée, la plaque est centrifugée. Veillez à ce que la position de chaque échantillon soit enregistrée sur la carte de la plaque. Ensuite, dans une autre plaque de 96 puits, aliquotez 59 microlitres d'eau sans nucléase par puits et ajoutez un microlitre de chaque réaction de PCR par puits afin de diluer l'ADN amplifié au ratio de un à soixante.

Une fois l'ADN dilué, utilisez une pipette multicanal pour transférer un microlitre de chaque échantillon PCR dilué dans le puits correspondant de la plaque contenant la solution libre de formamide. Une fois le programme terminé, les échantillons peuvent être analysés par électrophorèse standard sur gel d'agarose afin de confirmer que les fragments d'ADN de tailles prédites ont été amplifiés à ce stade. Les échantillons sont préparés pour l'analyse par électrophorèse capillaire fluorescente à l'aide d'un analyseur génétique FLA ; avant l'analyse, ajoutez un septum sur la plaque et centrifugez brièvement pour éliminer les bulles d'air et faire descendre l'échantillon au fond des puits.

L'IDE va dénaturer chimiquement les brins, il n'est donc pas nécessaire de procéder à une dénaturation thermique. Placer la plaque dans un plateau de chargement. Évaluer le produit de PCR marqué par électrophorèse capillaire, par exemple à l'aide de l'analyseur génétique ABBI'S 3130 xl.

Analyser les échantillons à l’aide d’un capillaire de 50 centimètres rempli de polymère POP7 servant de milieu de séparation. L’ADN migre vers l’extrémité du capillaire où un laser et un détecteur mesurent les marqueurs fluorescents ; ouvrez le logiciel de collecte de l’analyseur. L’analyseur doit être étalonné pour détecter tous les colorants utilisés avant l’analyse des échantillons, y compris l’étalon de taille. L’étalon utilisé pour ces échantillons est le G5 d’ABI. Injectez électrocinétiquement les échantillons à 1,6 kilovolt pendant 15 secondes.

Séparez les fragments en appliquant 15 kilovolts pendant 1800 secondes. La durée totale de chaque analyse est d'environ 45 minutes. Une fois l'analyse terminée, créez des fichiers de données pour chaque échantillon.

Les fichiers sont placés dans un dossier de plaque par le logiciel de collecte de l'analyseur à un emplacement prédéterminé. Les fichiers sont au format FSA. Les données FLA peuvent être analysées à l'aide d'un logiciel de lecture de pics, disponible gratuitement sur le site web d'Applied Biosystems.

Pour analyser les données, cliquez sur démarrer un nouveau projet, puis sur ajouter des fichiers. Chargez les fichiers de données sélectionnés dans le programme, y compris les contrôles positifs et négatifs. Sélectionnez et analysez les fichiers chargés.

Les résultats sont représentés sous forme de chromatogramme FLA. Les étalons de taille apparaissent sous forme de pics orange, tandis que les pics colorés représentent les échantillons d'ADN bactérien pour chaque locus analysé dans l'échantillon ; cliquez sur un pic pour déterminer sa taille en paires de bases. En raison de la synthèse par glissement du brin par la polymérase ADN, une famille de pics de la même couleur sera détectée pour certains locus de microsatellites.

Dans ces cas, le pic sélectionné est généralement celui d'amplitude maximale. Comparez les tailles des fragments dans chaque échantillon à la taille du témoin positif afin de déterminer le nombre de segments répétés en tandem présents pour chaque allèle testé, puis enregistrez les données dans un tableur Excel pour une analyse ultérieure. Sur cette figure, les empreintes génétiques d'isolats provenant de sept patients appartenant à trois familles différentes d'un même village sont présentées, et le nombre de répétitions en tandem pour chaque locus polymorphe analysé est indiqué.

Ces données suggèrent que deux membres de la famille B sont infectés par la même souche, tandis qu'un membre est infecté par une souche distincte. Les membres des familles C sont probablement infectés par la même souche. Tout comme les membres de la famille A. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'inclure systématiquement la PCR multiplex et l'analyse de la longueur des fragments afin d'obtenir des empreintes ADN V-N-T-R pour les patients atteints de lèpre se présentant en consultation.

Ces outils moléculaires novateurs viennent compléter l'épidémiologie conventionnelle dans le cadre de la lutte contre la lèpre.