Une méthode in vitro pour générer des échafaudages d’astrocytes dans des micro-colonnes d’hydrogel

Prenez une boîte de culture contenant un bateau à micro-colonnes composé de tubes creux de diamètre défini.

Les micro-colonnes, constituées d’un hydrogel, sont remplies d’un tampon pour éviter le dessèchement.

Sous un stéréomicroscope, retirez le tampon et ajoutez une solution de collagène glacée, un composant de la matrice extracellulaire.

Introduisez un média le long du bord intérieur du plat pour maintenir l’hydratation de la colonne. Incuber dans des conditions physiologiques pour que le collagène se polymérise, formant un revêtement à l’intérieur des micro-colonnes.

Ajoutez des astrocytes à l’intérieur des micro-colonnes et incubez pour favoriser l’adhésion des astrocytes au collagène.

Ensuite, remplissez le plat avec le milieu et maintenez-le dans des conditions physiologiques.

En raison du diamètre étroit des micro-colonnes, les astrocytes acquièrent une morphologie bipolaire avec des processus s’étendant sur toute la longueur.

Au fil du temps, les astrocytes s’auto-assemblent pour former un échafaudage tridimensionnel contenant des faisceaux denses de processus astrocytaires.

L’échafaudage d’astrocytes enveloppé d’hydrogel est prêt pour les analyses en aval.

À l’intérieur d’une enceinte de biosécurité, préparez une solution de 1 milligramme par millilitre de collagène de queue de rat de type I dans un milieu de co-culture, puis placez-la sur de la glace. Ajustez le pH de la solution ECM avec de l’acide ou de la base si nécessaire, jusqu’à ce que le pH soit stable dans la plage de 7,2 à 7,4. Transférez le bateau à microcolonne dans une boîte de Pétri de 35 ou 60 millilitres à l’aide d’une pince. À l’aide du stéréoscope pour vous guider, placez l’embout de 10 microlitres d’une micropipette à une extrémité de chaque microcolonne et aspirez pour vider la lumière du DPBS et des bulles d’air.

Chargez une micropipette P10 avec la solution de collagène. Placez l’embout de 10 microlitres contre une extrémité de chaque microcolonne et délivrez suffisamment de solution pour remplir la lumière, puis pipetez un réservoir d’ECM à chaque extrémité de la microcolonne. Une fois que toutes les colonnes ont été remplies, pipetez le milieu de co-culture en anneau autour de la boîte de Pétri pour éviter que les colonnes ne se dessèchent.

Incuber la boîte contenant les microcolonnes à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant au moins une heure pour favoriser la polymérisation du collagène avant d’ajouter des cellules. Ensuite, placez l’extrémité d’une micropipette P10 à l’une des extrémités d’une microcolonne et transférez environ 5 microlitres de solution cellulaire dans la lumière pour la remplir. Après avoir ensemencé toutes les microcolonnes dans un bateau, incubez-le à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant une heure pour favoriser la fixation des astrocytes à l’ECM.

Après la période d’incubation, remplissez soigneusement les boîtes contenant les microcolonnes ensemencées avec 3 ou 6 millilitres de milieu de co-culture pour des boîtes de Pétri de 35 ou 60 millimètres, respectivement. Maintenez les microcolonnes plaquées en culture à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pour favoriser l’auto-assemblage des faisceaux astrocytaires alignés, qui devraient former une structure en forme de câble après 6 à 10 heures.