Procédé de bio-impression 3D d’astrocytes corticaux murins

Prenez une suspension d’astrocytes.

Ajoutez une solution de bio-encre contenant de la gélatine, des dérivés de gélatine photoréticulables, des photoinitiateurs, du fibrinogène et de la laminine.

Transférez la suspension dans une seringue à l’aide d’une aiguille émoussée.

Refroidissez la seringue pour la gélification de l’encre biologique. Connectez la seringue à la tête d’impression de la bio-imprimante.

Positionnez l’aiguille de manière appropriée sur la plaque de culture. Lancez la bio-impression avec les paramètres définis et le design.

La bio-encre contenant des astrocytes est expulsée de l’aiguille et déposée en couches sur la plaque, formant une structure tridimensionnelle avec des astrocytes piégés.

Exposez la construction bio-imprimée à la lumière ultraviolette. Le photo-initiateur aide à la réticulation des dérivés de la gélatine, améliorant ainsi la stabilité de la bioconstruction.

Traiter avec de la thrombine et des ions calcium.

La thrombine, avec des ions calcium, convertit le fibrinogène en fibrine, s’assemblant en un réseau de biopolymères 3D stables.

Jetez la solution et lavez-la avec un tampon pour éliminer les agents de réticulation.

Ajoutez un milieu astrocytaire et incuber. La laminine favorise l’adhésion et la propagation des astrocytes, formant un tissu neuronal 3D riche en astrocytes.

Pour obtenir une concentration finale de 1 x 10⁶ cellules par millilitre, transférez 1 millilitre de solution de gélatine-gélatine-méthacryloyl-fibrinogène dans le tube contenant les cellules, et homogénéisez en pipetant doucement de haut en bas. À l’aide d’une pipette de 1000 microlitres, transférez lentement les astrocytes déposés dans une solution de bio-encre gélatine-gélatine-méthacryloyl-fibrinogène dans une seringue en plastique de 5 millilitres, en évitant la formation de bulles. Connectez une aiguille émoussée stérile de calibre 22 à la seringue.

Exposez la bio-imprimante à la lumière UV pendant 15 minutes, puis essuyez la bio-imprimante avec de l’éthanol à 70 %. Connectez ensuite la seringue à la tête d’impression de la bio-imprimante et rincez manuellement la bioencre pour éliminer les bulles restantes.

Pour effectuer une bio-impression, placez une boîte de culture de 35 millimètres sur la table de la bio-imprimante. Positionnez l’aiguille à 0,1 millimètre de la surface de la boîte de culture pour permettre le mouvement de l’aiguille, puis appuyez sur le bouton Imprimer. Une fois la bio-impression terminée, assurez-vous que la seringue s’éloigne de la boîte et fermez la boîte de culture. Placez la boîte de culture sous une lumière UV pour la réticulation gélatine-méthacryloyle.

À l’aide d’une spatule stérile, transférez la construction bio-imprimée dans une plaque à 24 puits, ajoutez 500 microlitres de solution de chlorure de calcium de thrombine et laissez agir pendant 30 minutes pour permettre la réticulation de la fibrine. Après avoir retiré la solution de réticulation, lavez la construction avec 2 millilitres de PBS. Ensuite, remplacez le PBS par 1 millilitre de milieu de culture d’astrocytes. Incuber à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, et changer de milieu tous les trois jours.