Dissociation et culture de neurones à partir d’échantillons de tissu hippocampique
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurosciences
0 vues • 3:35 min • July 8th, 2025
Commencez par des échantillons de tissu hippocampique contenant des neurones et diverses cellules non neuronales.
Ajouter une solution d’enzyme protéase. L’enzyme dégrade la matrice extracellulaire du tissu, initiant la dissociation cellulaire.
Laver avec un milieu de placage pour éliminer les enzymes résiduelles.
Pipetez le tissu digéré à plusieurs reprises pour dissocier mécaniquement les cellules du tissu, formant une suspension unicellulaire.
Centrifugez et retirez le surnageant. Remettez les cellules en suspension dans le milieu de placage.
Ensemencez les cellules sur une lamelle recouverte de poly-D-lysine dans une plaque multi-puits. La lysine améliore l’attachement cellulaire.
Remplacez le milieu de placage par un milieu de maintenance des neurones contenant des nutriments essentiels à la survie des neurones.
Rafraîchir la moitié du milieu avec un milieu d’entretien contenant de l’arabinosylcytosine ou Ara-C.
Ara-C pénètre dans les cellules et inhibe sélectivement la croissance des cellules non neuronales, entraînant leur mort.
Remplacez le milieu par un milieu d’entretien frais pour favoriser la survie des neurones.
Pour dissocier les neurones de l’hippocampe pour la culture, décongelez la solution d’enzyme protéase et préchauffez le milieu de placage à 37 degrés Celsius. Ensuite, rincez l’hippocampe disséqué avec SLDS. Ensuite, retirez-le et ajoutez 2 millilitres de solution d’enzyme protéase, puis incubez l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.
Ensuite, lavez deux fois les explants d’hippocampe avec 5 à 10 millilitres de milieu de placage et ajoutez 5 millilitres de milieu de placage. Dissociez les explants de l’hippocampe en cellules uniques en générant un petit vortex à l’aide d’une pipette avec un embout en plastique de 1 millilitre. Pipetez de haut en bas environ 40 fois, en évitant la formation de bulles d’oxygène jusqu’à ce que la solution devienne trouble et qu’il ne reste plus de gros morceaux d’explant.
Ensuite, centrifugez les cellules à 1 125 fois la gravité pendant 3 minutes. Retirez le surnageant avec les cellules immergées dans le milieu et remettez les cellules en suspension dans 145 millilitres de milieu de placage. Ensuite, ajoutez 1 millilitre de suspension cellulaire par puits dans une plaque de 24 puits. Incuber les cellules dans le milieu de placage à 37 degrés Celsius pendant deux à quatre heures.
Ensuite, retirez le milieu de placage et remplacez-le par un produit d’entretien frais. Après deux jours, remplacez la moitié du milieu par deux micromolaires d’Ara-C dissous dans un milieu d’entretien pour inhiber la croissance des fibroblastes, des cellules endothéliales et gliales. Ensuite, après avoir exposé les cellules à Ara-C pendant deux jours, remplacez le milieu par un milieu d’entretien frais.
Aperçu
Cet article décrit le processus de dissociation de neurones hippocampiques à partir d'échantillons de tissu pour la culture. Il présente les étapes nécessaires à la préparation des cellules en vue de leur entretien et de leur croissance in vitro.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Culture cellulaire
- Biologie neuronale
Contexte
- Les neurones de l'hippocampe sont essentiels à l'étude de diverses fonctions neurologiques.
- Les techniques de dissociation cellulaire sont indispensables pour isoler les neurones des cellules non neuronales.
- Un entretien adéquat des cultures neuronales est crucial pour la précision expérimentale.
- L'utilisation de l'Ara-C permet d'inhiber sélectivement la croissance des cellules non neuronales.
Objectif de l'étude
- Présenter une méthodologie détaillée pour l'isolement de neurones hippocampiques.
- Approfondir la compréhension des techniques de culture de cellules neuronales.
- Améliorer la survie et le maintien des neurones en culture.
Méthodes utilisées
- Préparation d'échantillons de tissu hippocampique.
- Utilisation d'une solution enzymatique de protéase pour la dissociation du tissu.
- Dissociation mécanique afin d'obtenir une suspension monocellulaire.
- Application de l'Ara-C pour inhiber la croissance des cellules non neuronales.
Résultats principaux
- Dissociation réussie de neurones à partir de tissu hippocampique.
- Maintenance efficace des cultures neuronales au fil du temps.
- Inhibition sélective démontrée des cellules non neuronales à l'aide de l'Ara-C.
- Mise en place d'un protocole fiable pour les études futures.
Conclusions
- Le protocole permet une isolation et une culture efficaces des neurones hippocampiques.
- L'utilisation de l'Ara-C est cruciale pour maintenir la pureté neuronale.
- Cette méthodologie peut être appliquée à diverses études en neurosciences.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La dissociation fiable et la culture de neurones hippocampiques permettent la création de systèmes in vitro standardisés, enrichis en neurones, destinés à la découverte précoce de médicaments en neurosciences. Ces cultures offrent une plateforme contrôlée pour l'analyse des mécanismes neuronaux, renforçant la confiance prédictive dans la validation des cibles et la réduction des risques mécanistiques. La sélectivité de cette méthode pour les populations neuronales améliore la continuité translationnelle et l'aide à la décision dans les portefeuilles de projets axés sur la neurobiologie.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet l'isolement de populations neuronales pures pour des études fondées sur des hypothèses.
- Facilite la réduction des risques mécanistiques en minimisant les facteurs de confusion non neuronaux.
- Permet la validation fonctionnelle de cibles dans des systèmes neuronaux pertinents pour la maladie.
- Améliore la fiabilité prédictive pour le tri précoce des portefeuilles.
Développement de tests et criblage
- Permet d'obtenir des cultures neuronales reproductibles pour la standardisation des tests.
- Permet la mesure quantitative des réponses neuronales aux composés.
- Facilite l'évolutivité et la réutilisation de la plateforme pour des campagnes de criblage.
- Réduit la variabilité en limitant l'interférence des cellules non neuronales.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les modèles in vitro avec la biologie neuronale pertinente pour la maladie.
- Permet une continuité allant de la découverte à la validation préclinique.
- Permet de prendre des décisions d'avancement ajustées au risque, fondées sur des données spécifiques aux neurones.
- Facilite l'exploration de biomarqueurs dans des systèmes enrichis en neurones.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Ce protocole de dissociation et de culture de neurones s'inscrit à l'interface entre la découverte précoce et le développement de tests, en fournissant des systèmes fondamentaux pour les criblages en aval et les études mécanistiques.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses et la clarification des voies dans des contextes spécifiques aux neurones.
- Écrans de sélection : Fournit des tests neuronaux reproductibles et quantitatifs pour l'évaluation de composés.
- Analytique : Permet la mesure de la viabilité et de la réponse neuronales, facilitant la comparaison statistique entre différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Offre un lien vers les modèles précliniques en maintenant la pureté et la pertinence neuronales.
- Réutilisation en entreprise : Établit un flux de travail standardisé adaptable à divers projets en neurobiologie.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans les études neuronales.
- Valeur opérationnelle : Renforce la standardisation, la reproductibilité et l'extensibilité des protocoles de culture neuronale.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller/arrêt et l'efficacité du capital en permettant des tests neuronaux robustes.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation et l'avancement ajustées au risque des actifs en neurobiologie.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation de tissus neuronaux et les techniques de culture cellulaire.
- Suppose un accès à des solutions d'enzymes protéolytiques, à des plaques revêtues de poly-D-lysine et à des environnements d'incubation contrôlés.
- Exige une standardisation interéquipes pour assurer la reproductibilité dans les études multicentriques.
- Une adaptation peut être nécessaire selon les sous-types neuronaux ou les espèces.
- Dépend d'une élimination efficace des cellules non neuronales pour des performances optimales du test.
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Dernière mise à jour : 29 août 2026