Dissociation et culture de neurones à partir d’échantillons de tissu hippocampique

Commencez par des échantillons de tissu hippocampique contenant des neurones et diverses cellules non neuronales.

Ajouter une solution d’enzyme protéase. L’enzyme dégrade la matrice extracellulaire du tissu, initiant la dissociation cellulaire.

Laver avec un milieu de placage pour éliminer les enzymes résiduelles.

Pipetez le tissu digéré à plusieurs reprises pour dissocier mécaniquement les cellules du tissu, formant une suspension unicellulaire.

Centrifugez et retirez le surnageant. Remettez les cellules en suspension dans le milieu de placage.

Ensemencez les cellules sur une lamelle recouverte de poly-D-lysine dans une plaque multi-puits. La lysine améliore l’attachement cellulaire.

Remplacez le milieu de placage par un milieu de maintenance des neurones contenant des nutriments essentiels à la survie des neurones.

Rafraîchir la moitié du milieu avec un milieu d’entretien contenant de l’arabinosylcytosine ou Ara-C.

Ara-C pénètre dans les cellules et inhibe sélectivement la croissance des cellules non neuronales, entraînant leur mort.

Remplacez le milieu par un milieu d’entretien frais pour favoriser la survie des neurones.

Pour dissocier les neurones de l’hippocampe pour la culture, décongelez la solution d’enzyme protéase et préchauffez le milieu de placage à 37 degrés Celsius. Ensuite, rincez l’hippocampe disséqué avec SLDS. Ensuite, retirez-le et ajoutez 2 millilitres de solution d’enzyme protéase, puis incubez l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Ensuite, lavez deux fois les explants d’hippocampe avec 5 à 10 millilitres de milieu de placage et ajoutez 5 millilitres de milieu de placage. Dissociez les explants de l’hippocampe en cellules uniques en générant un petit vortex à l’aide d’une pipette avec un embout en plastique de 1 millilitre. Pipetez de haut en bas environ 40 fois, en évitant la formation de bulles d’oxygène jusqu’à ce que la solution devienne trouble et qu’il ne reste plus de gros morceaux d’explant.

Ensuite, centrifugez les cellules à 1 125 fois la gravité pendant 3 minutes. Retirez le surnageant avec les cellules immergées dans le milieu et remettez les cellules en suspension dans 145 millilitres de milieu de placage. Ensuite, ajoutez 1 millilitre de suspension cellulaire par puits dans une plaque de 24 puits. Incuber les cellules dans le milieu de placage à 37 degrés Celsius pendant deux à quatre heures.

Ensuite, retirez le milieu de placage et remplacez-le par un produit d’entretien frais. Après deux jours, remplacez la moitié du milieu par deux micromolaires d’Ara-C dissous dans un milieu d’entretien pour inhiber la croissance des fibroblastes, des cellules endothéliales et gliales. Ensuite, après avoir exposé les cellules à Ara-C pendant deux jours, remplacez le milieu par un milieu d’entretien frais.