Name: Stem Cell Transplantation Stratégies pour la restauration de troubles cognitifs causés par la radiothérapie crânienne (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Découvrez la transplantation de cellules souches dans l'hippocampe de rats athymiques après radiothérapie crânienne. Cette méthode permet d'évaluer la migration cellulaire et de restaurer les fonctions cognitives.

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Ce travail a été soutenu par le NIH NINDS octroi R01 NS074388 581 (CL Limoli), California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) Grant RS1-00413 (LLC), CIRM Subvention de formation TG2-0115 (MMA), et une subvention du CIRM à Jupiter à l&#39;appui de la documentation vidéo.

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</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Beaucoup de recherches sont en cours d&#39;explorer la myriade de façons que les cellules souches peuvent être utilisées cliniquement pour restaurer les fonctions normales des tissus endommagés, âgés et malades 8. La réalisation éventuelle de ces efforts nécessitera une compréhension détaillée du comportement des cellules greffées dans des microenvironnements uniques qui sont distincts des tissus normaux intacts. Notre travail a démontré que dans le lit de tissu irradié, NSCs crânialement greffées peuvent fonctionnellement rétablir la cognition, où ils survivent, de migrer et de se différencier ainsi des lignées neurales et gliales 2. Justement comment ces cellules intermédiaires de récupération de la cognition est incertain à l&#39;heure actuelle, mais elle dépendra la réalisation d&#39;une série de procédures expérimentales soigneusement contrôlée d&#39;une manière reproductible. Nous avons détaillé ces procédures critique ici dans les efforts pour accélérer le potentiel de translation de thérapies par cellules souches pour le améliorant effets indésirables cognitifs associés à lagestion clinique du cerveau et d&#39;autres formes de cancer. D&#39;autres considérations qui sont susceptibles d&#39;avoir un impact significatif sur la qualité des données sont présentées ci-dessous. Thérapies de transplantation basée dépendent sur les cellules souches comme réactif critique, et en conséquence, il faut être prudent pour caractériser adéquatement les cultures, de maintenir la stérilité et l&#39;utilisation numéros passage appariés pour la fiabilité des résultats. Transplanté des cellules souches humaines ont été marqués avec BrdU avant la chirurgie, de fournir un moyen pour eux de suivi in vivo. Dans nos conditions expérimentales, NSCs transplantés n&#39;ont pas subi de prolifération extensive, de sorte que la dilution de l&#39;étiquette BrdU n&#39;était pas problématique. Alternativement, transplanté des cellules souches humaines peuvent être distinguées des cellules hôtes par immunomarquage pour l&#39;homme des marqueurs spécifiques tels que la protéine de la matrice nucléaire (h-NUC ou hNUMA) 9 ou humains spécifiques à l&#39;antigène nucléaire (HuNu) 2. Les cellules souches humaines pourrait aussi être étiquetés avecune variété de marqueurs fluorescents pour faciliter leur identification dans le cerveau hôte. Attention aux paramètres d&#39;irradiation de définir précisément les techniques de délivrance de la dose, et ceux qui sont décrits ici, le modèle actuel des pratiques cliniques en radio-oncologie. Reproductibles greffe de cellules souches dans le cerveau est également critique, et est réalisée en utilisant un instrument numérique stéréotaxique. La capacité de précision micromanipulate une micro-seringue pour l&#39;implantation de cellules souches dans les structures du cerveau comme l&#39;hippocampe petite réduit considérablement les erreurs humaines. Avec cet appareil, NSC ont été transplantés dans quatre sites distincts couvrant la partie antérieure des régions postérieures de l&#39;hippocampe du rat. Dorso-ventral (DV) coordonne été déterminée sur base d&#39;expérience avec les athymiques nude (ATN) chez le rat de telle sorte que les interventions chirurgicales ne causerait pas de dommages à la formation hippocampique 2. Une coupe coronale à travers le cerveau de rat révèle des structures clés de la formation hippocampique inclusuding l&#39;denté gyrus (DG), le denté hile (DH) et sous-champs CA1 et CA3 (fig. 8). NSCs transplantés, introduit dorsalement par le tractus aiguille visible (Nt, Redline), sont visualisés comme sombre coloration (brun), les cellules déposées au greffe le site de libération (Tr) juste en dessous du corps calleux (CC), qui par la suite migrer à travers le septo -temporelle axe de l&#39;hippocampe.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du produit </td><td> Tapez </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaire </td></tr><tr><td> Instrument numérique stéréotaxique W/45 ° et 18 ° Earbars </td><td> Crânienne greffe chirurgicale de configuration </td><td> Leica Microsystems (anciennement: MyNeuroLab) </td><td> 39463501 </td><td> Des accessoires utiles: Stage avec chauffe-eau et la variable source de courant (pour maintenir la température du corps pendant la chirurgie) </td></tr></tbody></table>

stem cell transplantation stratégies pour la restauration de troubles cognitifs causés par la radiothérapie crânienne

Stem Cell Transplantation Strategies for the Restoration of Cognitive Dysfunction Caused by Cranial Radiotherapy

La radiothérapie constitue souvent le seul recours cliniques pour les personnes atteintes de tumeurs cérébrales primaires ou métastatiques. Alors que bénéfique, l&#39;irradiation crânienne peut induire une diminution progressive et débilitante de la cognition qui peuvent, en partie, être causée par la déplétion des cellules souches neurales. Compte tenu de l&#39;augmentation de la survie des patients diagnostiqués avec un cancer du cerveau, la qualité de vie en termes de santé cognitive est devenue une préoccupation croissante, surtout en l&#39;absence de toute satisfaisante à long terme des traitements. Pour répondre à ce grave problème de santé, nous avons utilisé le remplacement de cellules souches en tant que stratégie de lutte contre le rayonnement induit par le déclin cognitif. Notre modèle utilise athymiques rats nus soumis à l&#39;irradiation crânienne. Le rayonnement ionisant est livré soit ensemble du cerveau ou comme un faisceau très concentré à l&#39;hippocampe par Lin oreille d&#39;un ccelerator (LINAC) radiochirurgie stéréotaxique basée. Deux jours après l&#39;irradiation, Hucellules souches neurales l&#39;homme (hNSCs) ont été transplantées dans stéréotaxique l&#39;hippocampe. Les rats ont ensuite été évalués pour des changements dans la cognition, la survie des cellules greffées et pour l&#39;expression de la différenciation des marqueurs spécifiques 1 et 4 mois après l&#39;irradiation. Nos paradigmes tests cognitifs ont démontré que les animaux greffés avec des hNSCs présentent des améliorations significatives de la fonction cognitive. Stéréologie Unbiased révèle significative de la survie (10-40%) des cellules greffées à 1 et 4 mois après la transplantation, dépend de la quantité et le type de cellules greffées. Cellules greffées migrent abondamment, de différencier le long lignées gliales et neurones, et d&#39;exprimer une gamme d&#39;immatures et matures marqueurs phénotypiques. Nos données démontrent des avantages directs cognitifs issus de greffer des cellules souches humaines, ce qui suggère que cette procédure pourrait un jour s&#39;offrir une stratégie prometteuse pour la restauration fonctionnel à long terme de la cognition chez les personnes soumises à radiot crânienneherapy. Pour promouvoir la diffusion des procédures critiques nécessaires pour répliquer et étendre nos études, nous avons fourni de la documentation écrite et visuelle de plusieurs étapes clés de notre plan expérimental, avec un accent sur stéréotaxique radiosurgey et la transplantation.

Patients atteints de tumeurs cérébrales systématiquement une radiothérapie crânienne, et tandis que bénéfique, ce traitement entraîne souvent des troubles cognitifs débilitante. Ce grave problème a résolu à l&#39;heure actuelle, aucun recours cliniques, et a conduit nos efforts pour concevoir des thérapies par cellules souches basées pour la récupération des diminutions cognitives radio-induites.

Stem Cell Transplantation Stratégies pour la restauration de troubles cognitifs causés par la radiothérapie crânienne

La radiothérapie constitue souvent le seul recours clinique pour les personnes atteintes de tumeurs cérébrales primaires ou métastatiques. Bien qu'elle soit bénéfique, l'irradiation crânienne...

L'objectif général de l'expérience suivante est de transplanter de manière reproductible des cellules souches dans l'hippocampe. Premièrement, des rats athymiques sont soumis à une radiothérapie stéréotaxique, simulant ce qui pourrait survenir lors de la prise en charge clinique d'un cancer cérébral. En laboratoire, des cellules souches neurales humaines sont cultivées en vue de la transplantation ; 1 million de cellules sont généralement nécessaires pour traiter un seul rat.Deux jours après l'irradiation, les cellules souches sont injectées lentement dans l'hippocampe à un emplacement précis. En fin de compte, le protocole montre la migration des cellules souches transplantées à travers l'hippocampe. J'ai eu pour la première fois l'idée de ces méthodologies lorsque j'ai commencé à envisager les perspectives d'utilisation des cellules souches pour inverser l'inhibition de la neurogenèse après irradiation crânienne. Généralement, les personnes familiarisées avec cette méthode éprouveront des difficultés, car la culture des cellules souches n'est pas chose aisée et exige une attention et des soins quotidiens dans des conditions de croissance sans antibiotiques.La démonstration visuelle de cette procédure permettra de démystifier le processus clinique utilisé pour la reconstruction d'images en vue de l'irradiation précise de petits volumes cérébraux bien définis. La procédure d'irradiation sera démontrée par le Dr Dante Rowa, professeur clinicien de mon département. La préparation des cellules souches sera illustrée par les techniciennes de mon laboratoire, Mme Mary Land et Catherine Tran, et le Dr Muja, chercheur postdoctoral, démontrera les procédures nécessaires à la transplantation.Nous utilisons un logiciel de radiothérapie guidée par l'image pour positionner précisément l'animal avant le traitement, ainsi qu'une radiothérapie modulée pour une irradiation ciblée avec un dommage radiologique minimal aux autres parties du cerveau. Vingt-quatre heures après un examen IRM, générez un autre volume d'images en coupe en plaçant l'animal sédaté dans un scanner CT utilisé en oncologie radiothérapeutique. Placez le rat dans la même position que celle utilisée pour l'examen IRM et configurez le scanner CT pour acquérir la région du crâne afin de produire les données de planification du traitement.Obtenez 106 images TDM avec une épaisseur d'image de 0,8 millimètre. Ensuite, transférez les données d'images IRM et TDM vers le logiciel de planification du traitement Eclipse. Utilisez Eclipse pour fusionner les données IRM et TDM en fonction de l'anatomie osseuse et de la correspondance des tissus mous.Il s'agit d'une étape dont la durée est variable et, selon la qualité des images, ce processus peut prendre de une à trois heures. Une fois qu'une fusion d'images satisfaisante est obtenue, délimitez les régions cibles à irradier ainsi que les organes critiques adjacents. L'irradiation peut être administrée à l'ensemble du cerveau ou limitée à des régions volumétriques spécifiques, telles que les hippocampes individuels.Les contours fournissent non seulement la localisation de ces organes, mais aussi des informations sur le volume qui seront essentielles pour adapter la distribution de la dose. Pour adapter la distribution de la dose, saisissez les informations concernant la dose cible, la conformité de la cible et les contraintes de dose pour les organes critiques dans la fenêtre d'optimisation de la dose d'Eclipse.Une fois le plan généré, Eclipse fournit la dose calculée superposée aux images axiales, coronales et sagittales, ainsi que sous forme d'histogramme volume-dose. C'est à ce stade que le plan doit être évalué afin de déterminer s'il convient pour l'administration ou s'il doit être amélioré. Pour commencer le processus d'irradiation, placer un rat sédaté sous une couverture en papier afin de le maintenir au chaud.Après quelques minutes, placez le rat sur la table de traitement de l'accélérateur linéaire de radiothérapie recouverte de la couverture, mais avec le crâne exposé. Veillez à le placer dans la même position que celle utilisée pour générer le scanner CT. Cette étape est essentielle pour garantir la précision de l'administration de la dose.Ensuite, acquérez des images orthogonales aux rayons X des rats sédatés à l'aide du système d'imagerie embarqué dans l'accélérateur linéaire de radiothérapie, fusionnez les images orthogonales aux rayons X avec un jeu d'images de référence fourni par Eclipse, puis appliquez les corrections de position nécessaires pour un alignement correct des images. Délivrez l'irradiation sous forme d'une dose fractionnée en 10 séances, selon un plan IMRT à six faisceaux pour un seul hippocampe, et selon un plan RapidArc à deux arcs pour l'irradiation des deux hippocampes. Une fois la délivrance du traitement terminée, retirez l'animal de la salle de traitement et laissez-le récupérer dans une cage d'attente chauffée.Pour préparer la chirurgie, utilisez des tondeuses électriques pour raser le pelage de la tête d'un rat A TN anesthésié. Nettoyez la zone rasée par des applications répétées de povidone-iodée et d'éthanol à 70 %, en travaillant sous une hotte à flux laminaire. Préparez les instruments stéréotaxiques, le micromoteur, le stérilisateur à lit sec et les contrôleurs.Gardez l’animal au chaud pendant la chirurgie en le plaçant sur une surface chauffante. Des gants stériles sont portés avant et tout au long de la chirurgie, puis pulvérisés avec de l’éthanol à 70 %. Le matériel chirurgical est conservé dans une hotte à flux laminaire dédiée.Pour maintenir des conditions aseptiques, recouvrez l'animal avec un petit champ opératoire de manière à n'exposer que la tête. Positionnez fermement la tête de l'animal dans le cadre stéréotaxique en insérant les barres auriculaires dans l'oreille externe. Faites extrêmement attention lors de l'introduction de l'extrémité de la barre auriculaire dans le conduit auditif.Placer la barre incisive en accrochant les incisives supérieures du rat et en ajustant la hauteur de la barre au point de référence standard. Ensuite, serrer le serre-nez. Centrer la position de la tête entre les barres auriculaires avec un mouvement latéral minimal afin d'atteindre le zéro stéréotaxique.Une fois l'animal en position, appliquez un onguent ophtalmique lubrifiant pour prévenir le dessèchement. Appliquez l'onguent une fois de plus pendant la chirurgie. À l'aide d'un scalpel stérile, pratiquez une incision cutanée médiane de deux centimètres le long du cuir chevelu.Nettoyez la zone à l’aide d’un applicateur stérile à embout en coton. Ensuite, insérez un rétracteur de dissection pour maintenir le périoste ouvert. Appliquez une pression ferme sur la zone en cas de saignement.À l’aide d’un applicateur en coton imbibé de peroxyde d’hydrogène à 1 %, retirer les tissus mous recouvrant le crâne jusqu’à ce que les sutures bgma et lambda soient visibles. L’aspect le plus délicat de la chirurgie stéréotaxique est le positionnement précis de la tête de l’animal dans le cadre stéréotaxique. Pour marquer les coordonnées stéréotaxiques exactes sur le crâne de l’animal, utiliser un atlas cérébral enroulé afin de déterminer les coordonnées stéréotaxiques précises en prenant comme référence la bgma. Dans cette étude, la transplantation de cellules souches est réalisée en quatre sites distincts en utilisant les coordonnées stéréotaxiques suivantes pour marquer les emplacements sur le crâne : tout d’abord, identifier la bgma.Mettre ensuite à zéro les trois coordonnées sur le contrôleur d'affichage numérique. Une fois les coordonnées remises à zéro, utiliser les coordonnées prédéterminées pour localiser les sites de transplantation et y apposer une marque à l'aide d'un marqueur fin fixé à un porte-sonde sur le châssis.Utilisez une perceuse pour faire des trous de 0,35 millimètre à travers le crâne à chaque emplacement marqué. Prenez soin d'éviter tout dommage à la membrane de Durham. En cas de saignement pendant le perçage, appliquez une pression ferme à l'aide d'un applicateur en coton.L'animal est désormais prêt pour la greffe. Les cellules souches neurales humaines utilisées pour la greffe doivent être préparées à l'avance et conservées sur glace jusqu'à leur utilisation. Lorsque vous êtes prêt, remplissez une microsyringe Hamilton de cinq microlitres, aiguille 30, avec la suspension cellulaire.Fixer la seringue remplie à un petit support de sonde sur le cadre stéréotaxique. Une fois déplacée en position correcte, insérer soigneusement la pointe de l'aiguille dans le trou du crâne jusqu'à ce qu'elle atteigne la surface du cerveau. Zéro le coordonnée DV sur le contrôleur d'affichage numérique, puis insérer délicatement l'aiguille à la profondeur souhaitée.Conserver l'aiguille en place pendant une minute. Au bout de ce temps, injecter les cellules à un débit de 0,25 microlitres par minute, pour un volume total d'un microlitre. Maintenir l'aiguille en place pendant huit minutes avant de la retirer afin d'éviter le reflux capillaire du contenu injecté par le trajet de l'aiguille, puis retirer lentement l'aiguille du site de transplantation à une vitesse de 0,5 millimètre par minute.Répétez cette procédure pour les sites de transplantation restants. Une fois les injections terminées, retirez le rétracteur cutané et utilisez des pinces émousses pour ramener doucement la peau au-dessus du crâne. Fermez la plaie en appliquant quatre à cinq agrafes stériles en acier inoxydable après la chirurgie.Placer l'animal dans une cage chauffée et surveiller sa récupération. Un mois après la transplantation, des échantillons cérébraux ont été sectionnés et colorés au BRDU pour détecter les NSCS transplantées, puis contre-colorés à l'hématine. La trajectoire de l'aiguille, représentée ici par la ligne rouge, indique le trajet d'injection ayant déposé les NSCS au site de libération de la greffe désigné par TR, tel qu'observé.Ici, les CSH transplantées ont montré une migration étendue depuis les régions du corps calleux et du CA1 vers le gyrus denté et les régions CA3 de l'hippocampe. Il est essentiel d'utiliser avec précision le jeu d'images IRM acquises en correspondance avec un jeu d'images TDM. Une fusion adéquate des images est cruciale pour l'identification et le délinéation ultérieure des régions hippocampiques avant la procédure de traitement ; acquérez des images radiographiques orthogonales afin de vous assurer que l'animal est correctement positionné. Pour garantir le succès de la transplantation, maintenez en tout temps un environnement chirurgical stérile.Marquez précisément les coordonnées d'Otax et retirez progressivement la microsyringe après l'injection afin d'éviter un reflux de liquide. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser une procédure de radiothérapie cliniquement pertinente à l'aide d'un modèle animal de votre choix, ainsi que la manière de transplanter chirurgicalement des cellules souches dans une région précise du cerveau.

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Nous décrivons la transplantation intraparenchymateuse de cellules progénitrices neurales humaines transduites avec un double vecteur rapporteur exprimant la protéine fluorescente vert luciférase (GFP) dans le cerveau de la souris. Après la transplantation, le signal de la luciférase est mesuré à plusieurs reprises à l’aide de la bioluminescence in vivo et de cellules greffées exprimant la GFP identifiées dans des sections du cerveau à l’aide de la microscopie à fluorescence.

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Essai randomisé, en triple aveugle et contrôlé en parallèle de la stimulation transcrânienne à courant continu pour la réadaptation cognitive après un AVC

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