Isolement et culture de cellules à partir d’un gliome pontique intrinsèque diffus

Commencez par des fragments de tissu du tronc cérébral contenant un gliome pontique intrinsèque diffus, une tumeur dérivée de cellules progénitrices gliales dans un environnement riche en nerfs myélinisés.

Traiter avec des enzymes protéolytiques pour dégrader la matrice extracellulaire du tissu.

Après l’incubation, pipeter à plusieurs reprises le contenu pour faciliter la dissociation cellulaire et la dégradation de la gaine de myéline.

Filtre et centrifugeuse pour collecter les cellules. Retirez le surnageant et mettez-le en suspension dans un tampon froid.

Ajouter une solution de saccharose pour la séparation par gradient de densité et bien mélanger.

Ensuite, centrifugez pour séparer les cellules les plus lourdes des débris de myéline plus légers.

Retirez la couche de myéline et ajoutez un tampon de lyse des globules rouges.

Ajouter un tampon froid pour arrêter l’action de lyse. Centrifuger et retirer le surnageant pour éliminer les globules rouges lysés.

Remettez les cellules en suspension dans un milieu neurobasal chaud et cultivez-les dans une fiole non enrobée.

L’absence de facteurs neurotropes provoque la mort neuronale, tandis que les cellules progénitrices gliales utilisent des nutriments et des facteurs de croissance, ce qui conduit à la prolifération. Ajouter un milieu frais pour maintenir les niveaux de facteurs de croissance.

Au fil du temps, ces cellules s’agrègent spontanément en amas de cellules, formant des neurosphères flottantes librement.

Dans cette procédure, centrifugez le tube conique contenant les fragments de tissu restants pendant cinq minutes. Après cela, retirez le surnageant et ajoutez la solution de digestion enzymatique préchauffée de sorte qu’il y ait 5 millilitres de solution de digestion pour 1 millilitre de tissu. Ensuite, scellez le couvercle du tube conique avec un film de laboratoire et incubez la réaction sur un rotateur à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Après l’incubation, triturez doucement les échantillons. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres, pipetez l’échantillon de haut en bas 6 à 8 fois et évitez de générer des bulles d’air excessives. Ensuite, ajoutez une pointe de pipette de 1000 microlitres à l’extrémité de la pipette et triturez l’échantillon 6 à 8 fois supplémentaires.

Laissez les morceaux restants se déposer au fond du tube. Ensuite, retirez et filtrez le surnageant avec la cellule toujours suspendue à travers un filtre de 100 microns dans un nouveau tube conique de 50 millilitres étiqueté dissociation enzymatique, et stockez-le sur de la glace. Ensuite, centrifugez le tube de dissociation enzymatique pendant cinq minutes et poursuivez la centrifugation par gradient de saccharose. Si l’échantillon est toujours en suspension dans la solution, centrifugez-le pendant cinq minutes.

Ensuite, retirez le surnageant et remettez le tissu en suspension dans 20 millilitres de HBSS froid sans calcium ni magnésium. Ensuite, portez le volume à 25 millilitres avec du HBSS froid. Lentement, ajoutez 25 millilitres de solution de saccharose de 1,8 molaire et retournez le tube pour mélanger. Il en résulte un gradient de saccharose de 0,9 molaire.

Ensuite, centrifugez l’échantillon sans pause pendant 10 minutes. Aspirez soigneusement les débris de myéline et autant de solution de saccharose que possible. Ensuite, lavez l’échantillon en ajoutant 30 millilitres de HBSS froid sans calcium ni magnésium, et en mélangeant doucement. Après cela, centrifugez-le pendant cinq minutes.

Dans cette procédure, retirez le surnageant de lavage. Ajoutez 5 millilitres de tampon de lyse ACK et remettez doucement la pastille cellulaire en suspension en faisant tourner le tube pendant une minute à température ambiante. Ensuite, éteignez la lyse en ajoutant 30 millilitres de HBSS froid sans calcium ni magnésium.

Ensuite, centrifugez-le pendant cinq minutes. Remettez en suspension la pastille cellulaire finale dans 10 à 15 millilitres de TSM complet chaud avec des facteurs de croissance, et quantifiez la densité cellulaire viable sur un hémocytomètre en utilisant l’exclusion du bleu trypan. Ensuite, transférez la suspension cellulaire finale dans un nouveau flacon de culture T75. Ajoutez des facteurs de croissance supplémentaires tous les deux jours pour maintenir les niveaux globaux de facteurs de croissance et surveiller le développement des neurosphères des cellules tumorales.