Isolement de neurones marqués par fluorescence à partir d’un cerveau murin

Prenons l’exemple d’un cortex de souris transgénique contenant des neurones exprimant des protéines fluorescentes.

Fixez-le sur un porte-échantillon.

Montez le support sur le plateau du vibratome contenant de l’aCSF oxygéné pour maintenir les conditions physiologiques des tissus.

À l’aide des paramètres définis, obtenez des coupes coronales.

Placez les tranches dans un support grillagé contenant de l’aCSF oxygéné et des bloqueurs d’activité pour les stabiliser.

Traitez les tranches avec des protéases pour digérer la matrice extracellulaire et détacher les cellules.

Laver avec un LCR pour éliminer les protéases.

Transférez les tranches dans une plaque de culture avec de l’aCSF et du sérum.

Sous un microscope à fluorescence, disséquez des régions de coupe contenant des neurones fluorescents.

Transférez les fragments disséqués dans un tube contenant du LCR et du sérum.

Dissocier mécaniquement le tissu pour former une suspension unicellulaire. Transférez les cellules dans une plaque de culture contenant du LCR.

Sous un microscope à fluorescence, utilisez une pipette capillaire pour prélever les neurones fluorescents.

Distribuez ces neurones dans une plaque de culture contenant du LCR pour une analyse plus approfondie.

Disséquez le cerveau d’une souris euthanasiée en ouvrant le crâne avec un petit ciseau et en extrayant le cerveau frais à l’aide d’une pince fine sans endommager le cortex. Placez le cerveau dans un aCSF réfrigéré et oxygéné, en laissant une pierre à air attachée à 5 % d’oxygène équilibré en dioxyde de carbone pendant toute la durée de la section.

Positionnez le cerveau sur le mandrin vibrant, et coupez des sections coronales ou sagittales à 300 microns d’épaisseur. Collectez autant de sections que nécessaire pour obtenir un minimum de 10 à 50 cellules marquées. Placez les tranches sur un porte-tranches en coton placé à l’intérieur d’un bécher afin qu’elles soient baignées dans un aCSF oxygéné.

Déplacez les tranches dans le bécher contenant un LCR avec des bloqueurs d’activité et bloquez pendant 15 à 20 minutes à température ambiante tout en faisant bouillonner l’oxygène à l’aide d’une pierre à air. Déplacez les tranches dans le bécher contenant de l’aCSF avec la solution de protéase pour effectuer une digestion douce à température ambiante. Après la digestion, laver la protéase en remettant les tranches dans le bécher contenant du LCR avec une solution de bloqueur d’activité pendant 5 à 10 minutes à température ambiante. Continuez à faire bouillonner l’oxygène.

Ensuite, préparez une boîte de Pétri de 100 millimètres contenant de l’aCSF avec 1 % de FBS à température ambiante et déplacez des sections individuelles dans la boîte pour la microdissection. Sous une lunette de dissection fluorescente, utilisez une paire de pinces fines pour micro-disséquer les zones et les couches d’intérêt ayant un minimum de 10 à 50 cellules.

À l’aide d’une pipette Pasteur, déplacez les morceaux micro-disséqués dans un tube de microcentrifugation de 2 millilitres contenant environ 0,8 millilitre de FBS à 1 % dans une solution de LCR. Triturez le tissu disséqué dans le tube de microfuge à température ambiante.

Effectuez environ 10 coups avec chacune des pipettes Pasteur flammées, en commençant par la plus grande et en terminant par le plus petit diamètre de sortie. Distribuez les cellules dissociées dans une boîte de Pétri de 100 millilitres contenant de l’aCSF oxygéné, et attendez 5 à 7 minutes pour que les cellules se stabilisent progressivement.

Observez le signal GFP et RFP à l’aide d’un microscope de dissection. Identifiez les débris en examinant la morphologie sous un éclairage en fond clair. Une fois qu’une zone de cellules avec peu de débris a été identifiée, utilisez le capillaire et le tube attaché pour prélever les cellules en bloquant l’extrémité de la valve du tube avec la langue. Ensuite, positionnez le capillaire près des cellules. Relâchez le bloc sur le capillaire et bloquez à nouveau rapidement pour capturer la cellule à l’aide de l’action capillaire.

Déplacez le capillaire dans une boîte de Pétri de 100 millimètres avec de l’aCSF fraîchement oxygéné et soufflez doucement dans le tube tout en observant l’extrémité capillaire sous l’optique de fluorescence pour distribuer les cellules dans la boîte. Répétez la procédure de collecte jusqu’à ce que 100 à 150 cellules soient collectées, en vous assurant que les contaminants tels que les débris sont minimes dans les optiques de contraste interférentiel différentiel en fond clair.