Microfabriqués post-Array-détecteurs (mPADs): une approche pour isoler les forces mécaniques

Bonjour, je m’appelle Nathan Snia Decky et je suis accompagné aujourd’hui de Wes Ligan, Robbie Desai et Mike Yang. Et nous venons du laboratoire de Chris Chen ici à l’Université de Pennsylvanie. Dans cette vidéo, nous allons présenter notre approche pour mesurer les forces d’attraction cellulaire à l’aide d’un réseau micro-fabriqué de poteaux.

Les forces de traction sont générées par les interactions entre la myosine et l’acton et jouent un rôle important dans notre physiologie. Au cours du développement, ils permettent aux cellules de se déplacer d’un endroit à l’autre afin de former les premières structures de nos tissus. Et ils aident également au processus de guérison, car ils sont nécessaires à la fermeture des plaies ou à la migration et au rampement des leucocytes dans notre corps.

Mais malheureusement, ces mêmes forces peuvent être préjudiciables à notre santé dans le cas d’un cancer, de métastases ou d’une croissance vasculaire vers une tumeur. Il existe donc très peu de méthodes permettant de mesurer ces forces de traction de manière quantitative, et en particulier à l’échelle micro et nanométrique des cellules individuelles. La plupart des méthodes courantes pour étudier les cellules in vitro ont été utilisées avec des plats à fond de verre ou des plats en polystyrène, mais ce sont des substrats très rigides et ils ne le sont pas, ils ne nous permettent pas de mesurer physiquement les forces de traction et les diffamations qu’une cellule provoque.

Il a donc été très difficile de comprendre les mécanismes sous-jacents des forces de traction sans une sorte de lecture physique. C’est pourquoi, dans le laboratoire de Chris Chen, nous disposons d’une technique qui nous permet de surmonter ces limitations. Notre méthode est basée sur un réseau vertical de porte-à-faux flexibles, dont la rigidité et l’échelle de taille sont telles que les cellules individuelles se répartissent sur plusieurs porte-à-faux et les dévient dans le processus.

Les dimensions que nous utilisons le plus fréquemment sont de trois microns de diamètre, des poteaux cylindriques de diamètre, de 10 microns de haut avec un espacement de neuf microns de centre à centre et un réseau rectangulaire. Cependant, ces dimensions peuvent être modifiées pour s’adapter à une variété d’études cellulaires. Nous commençons par un master en silicium rigide que vous pouvez voir ici, puis nous le traduisons en porte-à-faux PDMS flexibles que nous voyons ici.

En utilisant cette technique, nous pouvons mesurer les déviations de cantilevers individuels au microscope et remonter les forces de traction cellulaires avec l’amplitude et la direction requises pour générer de telles déviations. Nous avons transformé ces substrats en pastilles M pour des détecteurs de micro-post-réseau et dans cette vidéo, nous allons vous montrer comment fabriquer les pastilles M, en commençant par le master en silicone à travers la réplication PDMS, et enfin le calcul de la modulation et de la contractilité cellulaire. Bonjour, nous voici dans la salle blanche de nos laboratoires.

Il s’agit d’une pièce sans poussière et sensible à la lumière qui nous permet de fabriquer le SU huit poteaux qui serviront de maître du silicium. Nous allons d’abord commencer avec une plaquette de silicium et avec celle-ci, nous l’enduirons de SU huit, de résine photo, de SU huit, d’une résistance négative et d’une sensibilité à la lumière. Ainsi, lorsque nous faisons briller la lumière à travers ce masque photo, la lumière modélise les micro-poteaux, puis forme une structure tridimensionnelle, qui sera ensuite les huit poteaux SU que nous coulons ensuite dans PDMS.

Ainsi, une fois que nous avons terminé tout notre traitement, la plaquette ressemblera à ceci, c’est là que nous avons le micro-pilier, les structures de micro-poteaux déjà fabriquées dans la plaquette. Donc, pour faire les masters, nous commençons par une plaquette de silicium nue et celle-ci a été nettoyée avec un traitement à l’ozone pendant sept minutes et nous avons également déshydraté cette plaquette pendant 30 minutes à 120 degrés Celsius. Nous allons faire tourner SU huit 2002 dessus pour former une couche de base très fine pour les poteaux.

Donc, parce que nous allons faire tourner SU huit, je vais porter un masque à gaz, recharger la plaquette dans ce support ici, dépoussiérer toute poussière qui pourrait s’y trouver, la placer sur la toupie, nous allons vérifier qu’elle est centrée Et puis nous procéderons à la coulée du SU huit 2002 par-dessus. Ensuite, nous allons faire tourner la plaquette. Nous les plaçons ensuite sur la plaque chauffante, la cuisson molle.

Nous faisons cela pendant une minute par la suite. Nous le prenons ensuite et le transférons sur la plaque chauffante à 95 degrés. Et nous faisons cela pendant deux minutes.

Et quand c’est terminé, nous le prendrons maintenant et partirons pour faire l’exposition aux inondations dans l’aligneur de masque. D’accord, nous venons de faire tourner SU huit, la première couche de SU huit sur cette plaquette, et maintenant nous devons inonder l’exposition de la plaquette entière pour créer cette première couche de base pour les micro-poteaux. Nous devons donc donner à cette exposition de 70 millijoules.

Nous devons donc ensuite mesurer l’intensité réelle de la lumière dans notre aligneur de masque ici. Nous chargeons donc le compteur dans le poids dans l’aligneur de masque. Nous l’exposons ensuite avec de la lumière.

C’est la lumière UV ici. Nous chargeons la plaquette de silicium sur l’aligneur de masque, la plaçons dans l’aligneur de masque. Et nous n’avons pas de masque cette fois-ci, afin d’exposer tout le film.

Mettons l’obturateur et allons-y et augmentons d’une minute d’exposition et nous allons continuer et exposer. Ainsi, au bout d’une minute, le système est terminé, nous pouvons alors retirer la plaquette. Et maintenant, nous devons faire la cuisson post-exposition.

Nous venons donc d’exposer cette plaquette et nous allons maintenant ajouter de la chaleur pour provoquer la réaction de réticulation de ce premier revêtement de SU huit. Nous le plaçons donc sur une plaque chauffante à 65 degrés pendant une minute, puis nous transférons sur une plaque chauffante à 95 degrés pendant deux minutes. Après le processus de deux minutes, nous éteignons ensuite la plaque chauffante et laissons la plaquette refroidir à température ambiante, ce qui prend environ 30 minutes.

Nous avons donc filé notre deuxième couche de SU huit sur cette plaquette. Et maintenant, nous devons réellement exposer cela à travers le masque photo. Cette fois, nous allons utiliser un filtre UV pour bloquer cette lumière UV profonde.

Il s’agit d’un verre optique Hoya que vous pouvez obtenir, mais cette fois, nous devons à nouveau mesurer l’intensité. Nous allons donc utiliser notre posemètre ou le filtre sur le dessus pour mesurer l’intensité qui a été filtrée. Ensuite, nous allons charger le masque dans l’aligneur de masques.

Cet interrupteur crée un vide qui maintient le masque en place. Nous le placerons ensuite dans l’aligneur de masque. Nous placerons ensuite le filtre sur le dessus, puis nous y chargerons notre plaquette.

Nous voulons nous assurer qu’il y a un bon contact, alors nous le soulevons en contact, puis nous commencerons l’exposition Après l’exposition, nous retirerons notre plaquette de l’aligneur de masque. Nous avons donc maintenant des zones qui ont été exposées de manière sélective. Nous allons l’emmener au four, sur les plaques chauffantes pour faire la cuisson post-exposition dessus.

Nous venons donc de terminer le po, la cuisson finale post-exposition, et maintenant nous allons développer cette plaquette afin que nous puissions réellement obtenir les structures tridimensionnelles. Ce que nous allons faire, c’est que nous allons laver cela, développer cela dans P-G-M-E-A, ce qui éliminera le SU huit non exposé. Nous commençons donc d’abord par un plat de P-G-M-E-A et nous y posons la gaufrette pendant deux minutes avec une légère agitation.

Je vais donc laisser tomber pendant deux minutes. Nous allons donc passer à un deuxième plat de P-G-M-E-A. Cela éliminera ce P-G-M-E-A saturé avec SU huit.

Après 10 secondes, nous l’intégrerons à l’IPA. Cela emporte le P-G-M-E-A. Nous l’avons mis ici pendant 20 secondes, encore une fois avec une légère agitation.

Et puis, en ce moment, nous avons les structures de poteaux autoportantes. Nous allons donc le mettre dans de l’hexane, qui a une faible tension superficielle. Nous allons laver pendant cinq secondes dans un, puis deux hexanes, puis nous sommes prêts à le sécher au sèche-cheveux.

Nous venons donc de développer la plaquette et nous allons maintenant la placer sur une plaque chauffante et augmenter lentement la température jusqu’à 50. Et ce qui se passe, c’est que cette température plus élevée réticule, le SU huit pour le rendre plus rigide structurellement, et nous le laissons sur cette plaque chauffante pendant la nuit. Donc, entre 14 et 20 heures, puis nous éteindrons la plaque chauffante et la laisserons refroidir à nouveau à température ambiante.

Donc, ce que nous devons faire, c’est réduire cette plaquette en dés à une taille plus petite. Nous voulons essentiellement couper cette plaquette de silicium et créer une petite puce de ce motif interne ici. Et ça va ressembler à quelque chose comme cette structure là-bas où ils vont utiliser de l’époxy.

Et nous allons coller cette puce sur une lame de verre comme ça. Et cela fournit un support structurel. Donc, couper une plaquette en dés, c’est une sorte d’art, mais ce que vous pouvez faire, c’est utiliser un scribe en diamant et commencer par un seul bord.

Et à cause des plans cristallins, il suffit de mettre une petite encoche maintenant qui a créé une fracture, que je peux ensuite taper avec cet outil, nous pouvons l’enlever et nous pouvons ensuite faire plus de coupes ici jusqu’à ce que nous obtenions une petite structure comme celle-ci. Ensuite, vous placez rapidement la puce de silicium sur le verre et la montez en place. Et vous laissez cela se fixer.

Et donc, une fois que vous avez terminé, vous aurez un, vous aurez un appareil similaire à celui-ci. Nous avons donc monté le master en silicium sur cette lame de verre et nous allons maintenant lui donner une couche de floy, ce qui aidera à libérer cette structure du PDMS plus tard. Nous allons donc placer la puce dans cette dessiccation, puis nous allons prendre quelques gouttelettes de ce tri Chloro Siling placer quelques gouttes dans la dessiccation.

Nous le faisons à l’intérieur de la hotte parce qu’il s’agit d’un sous-produit du gaz hydrochlorhydrique, ce qui est assez dur. Allez-y et fermez le couvercle, fixez-le à l’aspirateur, puis nous le laissons reposer à partir de l’aspirateur et nous laissons ce dépôt pendant la nuit pour obtenir un bon revêtement sur toute la plaquette de silicium. Bonjour, je m’appelle Wesley Ligan.

Je suis étudiant diplômé dans le laboratoire de Christopher Chen. À ce stade, Nate vous a montré comment créer un master en silicone pour nos substrats ED. Cependant, avant de pouvoir utiliser cet outil pour mesurer la contractilité cellulaire, il est nécessaire de reproduire d’abord les photostructures rigides à l’aide d’un polymère de silicone élastomère.

Notre première tâche est de générer un modèle négatif du master en silicone que nous avons fabriqué précédemment. Pour ce faire, nous utilisons un élastomère de silicium appelé PDMS ou Polymethyl Sloane pour notre polymère PDMS. Nous ajoutons maintenant un rapport de un à 10 d’agent de durcissement.

Une fois que nous avons pesé la solution, il est nécessaire de bien mélanger le polymère PDMS et l’agent de fuite croisée. Ce mélange introduit évidemment beaucoup de bulles d’air dans notre solution. Donc, à ce stade, il est nécessaire de le couvrir et de le dégazer dans le vide, dessécher.

Une fois que le PDMS est complètement dégazé et que toutes les bulles sont remontées à la surface et ont éclaté, nous pouvons le retirer de la dessiccation sous vide. Nous pouvons maintenant utiliser ce mélange de PDMS et d’agent de réticulation pour générer un moule négatif de notre maître silicium. Et pour ce faire, nous utilisons un moule à tarte et plaçons notre maître en silicone monté au centre de celui-ci.

Nous versons ensuite soigneusement la solution de polymère DGA dans le plat sur le dessus de la plaquette de silicium en essayant d’empêcher la formation de bulles supplémentaires. En règle générale, nous essayons de verser le polymère d’environ un quart de pouce d’épaisseur. Vous pouvez voir que ce processus introduit inévitablement quelques bulles d’air dans le mélange.

Alors maintenant, nous mettons ce plat de côté pendant environ 30 minutes pour permettre aux bulles de remonter à la surface et d’éclater. Nous pouvons voir qu’après l’avoir laissé reposer, il reste encore quelques bulles d’air à la surface du PDMS. Cependant, comme ceux-ci se trouvent à la surface supérieure, nous pouvons maintenant utiliser une rafale rapide d’azote pour faire éclater les bulles restantes.

Afin de réticuler complètement la solution PDMS et CROSSLINKER et de générer un modèle négatif rigide de notre maître silicium, nous le cuisons à 110 degrés Celsius pendant 20 minutes. Nous pouvons voir qu’il y a une fine couche de PDMS sur le substrat de silicone. Et avant de pouvoir décoller les deux, il est nécessaire de couper d’abord cette couche.

Ensuite, nous pouvons greffer cette couche supérieure et la décoller doucement du substrat de silicium. À ce stade, nous pouvons inverser et décoller très lentement le substrat de silicium négatif, le substrat PDMS négatif du maître en silicone. D’accord, nous le faisons en maintenant une extrémité vers le bas et en décollant doucement le substrat PDMS.

Vous pouvez voir l’avance de l’avant à mesure que le substrat se décolle du maître en silicone. Maintenant que nous avons généré le moule négatif A-P-D-M-S de notre maître silicone, nous pouvons le découper en quatre moules négatifs individuels pour fabriquer les substrats finaux du tampon. Il est important à ce stade de ne pas toucher le haut du substrat négatif avec des pinces ou vos gants pour éviter d’endommager la surface.

Donc, à ce stade, nous avons généré quatre modèles négatifs individuels à partir du maître en silicone composés de puits de trois microns de diamètre, neuf microns de profondeur. Afin de régénérer les surfaces en porte-à-faux surélevées, nous pouvons couler à nouveau sur ces moules négatifs à partir d’un PDI PDMS utilisant PDMS. Cependant, avant de faire cela, il est nécessaire de rendre ces moules négatifs non adhésifs en les recouvrant d’un fluoros.

Nous le faisons dans une chambre à plasma de cent watts à pleine puissance pendant une minute. Après avoir permis à la chambre de pomper le retour sur le plasma, cela génère un champ de gaz ionique qui grave la surface supérieure du PDMS et la rend plus adhérente aux molécules fluoro Cy Lane. Après avoir retiré les moules négatifs de la dessiccation sous vide, vous pouvez voir ici que ce qui nous reste est un réseau de puits de trois microns par 10 microns de profondeur dans une couche PDMS non adhésive.

Afin de régénérer les porte-à-faux verticaux, que nous utilisons pour les substrats mpad, il est nécessaire de les relancer en utilisant notre même mélange PDMS et cela nous laissera avec un réseau indépendant positif de porte-à-faux élastomères, qui reflètent à l’identique le maître en silicium que nous avons fabriqué précédemment. La première étape de cette procédure consiste à transférer nos moules négatifs non adhésifs sur un gabarit de montage que nous avons fabriqué à partir de bandes PDMS et d’une lame de microscope en verre. La raison de cette plate-forme deviendra claire à l’étape suivante.

À ce stade, nous pouvons déposer une petite goutte de notre même mélange de 10 à un de PDMS pour réticuler déjà Degas sur la surface supérieure de chacun de nos moules négatifs. Seule une petite quantité de PDMS est nécessaire pour qu’il ne coule pas sur le bord des moules négatifs. À ce stade.

Afin de répartir plus complètement le PDMS sur la surface supérieure des moules, nous pouvons en saisir un à l’aide d’une pince, l’inverser et le mettre en contact avec le moule adjacent en l’étalant soigneusement autour du PDMS pour couvrir entièrement tout le substrat. Faites très attention dans cette étape à ne pas introduire d’autres bulles dans la solution PDMS supérieure qui peut ensuite se répéter avec les deux autres puits, les deux autres moules. Maintenant que nous avons un revêtement PDMS plus uniforme sur la surface supérieure, nous pouvons placer ce gabarit dans un dessiccation sous vide pour éliminer davantage toutes les bulles qui peuvent être piégées dans le film PDMS sur le dessus de nos moules négatifs.

Ce processus prend généralement environ 30 minutes. Pendant que nos moules négatifs dégazent, nous pouvons nettoyer les substrats en verre de 22 x 22 millimètres, qui deviendront le lieu de montage final des coussinets. La première étape de ce processus consiste à souffler toutes les particules de poussière à l’aide d’azote comprimé.

Nous exposerons les lamelles de verre à un plasma de gaz, ce qui enduisera la surface et la rendra plus adhérente au PMS, sur lequel nous collerons à l’étape suivante. Après avoir laissé la couche supérieure de PDMS à DGA pendant environ 30 minutes et activé par plasma les lamelles de couverture en verre, nous pouvons alors retirer notre gabarit et mettre en contact la surface supérieure des lamelles de couverture en verre, qui a été exposée au plasma de gaz, avec la couche PDMS au-dessus des moules négatifs. En règle générale, il est utile de mettre d’abord un bord de la lamelle de verre en contact avec le PDMS, puis de laisser le reste de la lamelle de verre se déposer dans un SH afin que le PDMS s’étale en forme de feuille.

Cela permet de réduire les bulles introduites dans le film PDMS. À ce stade, nous pouvons appuyer doucement sur la surface supérieure de la lamelle en verre à l’aide de notre pince pour repousser tout excès de PDMS et pousser la lamelle contre la croix PDMS au centre du modèle. Cela empêchera le glissement de se déplacer pendant le durcissement du PDMS.

Nous répétons cette opération pour les autres substrats. À ce stade, nous pouvons transférer l’ensemble du modèle dans le four et cuire à 110 degrés Celsius pendant 22 heures. Après avoir laissé l’ensemble refroidir à température ambiante, nous pouvons ensuite retirer nos substrats, les retourner et décoller soigneusement le moule négatif de la lamelle de verre.

Il est important de le faire lentement et uniformément afin d’éviter d’écraser les poteaux ou de les arracher du substrat de verre. Nous pouvons voir qu’après avoir décollé le moule négatif, nous nous retrouvons avec un ensemble de porte-à-faux qui imitent précisément le Silicon Master, sauf que maintenant ils sont dans un élastomère PDMS flexible. D’accord, à ce stade, nous vous expliquons comment nous générons le Silicon Master de nos substrats Emad.

Nous avons ensuite utilisé un processus de moulage de réplique pour générer une réplique exacte à l’aide d’un polymère élastomère A-P-D-M-S de sorte que les porte-à-faux sont maintenant flexibles pour permettre à la cellule de s’étendre, de se contracter et de dévier les porte-à-faux dans le processus. À ce stade, nos substrats sont prêts pour le traitement pour la culture cellulaire. Maintenant que nous avons vu comment fabriquer et reproduire des moules pour fabriquer l’EDS, nous allons faire quelques étapes supplémentaires afin de rendre l’EDS fonctionnel afin que nous puissions nous cultiver et analyser par la suite les forces de traction.

Mais avant de le faire, nous devons faire trois choses. Nous devons rendre les extrémités des poteaux adhésives aux cellules. Deuxièmement, nous devons étiqueter par fluorescence le PDMS afin de faciliter la visualisation et l’analyse des déflexions des poteaux.

Et troisièmement, nous devons rendre les parois latérales des poteaux ainsi que la base des poteaux non adhésives aux cellules afin que les forces de traction ne soient exercées qu’au niveau des extrémités des poteaux. Nous verrons donc comment ces étapes se déroulent via une stratégie basée sur l’impression par micro-contact dans les minutes suivantes. Mais d’abord, l’étape suivante consiste à nettoyer l’excès de P-D-S-P-D-M-S de l’eds.

Donc, comme je l’ai mentionné, la première étape consiste à prendre le substrat EDS, que West vient de vous montrer comment les générer et les couper. L’excès de PDMS résultant du durcissement du couvercle en verre glisse contre le moule négatif et à l’aide d’une lame de rasoir tranchante. L’excès de PDMS, vous le faites en posant la lame de rasoir verticalement sur le substrat au bord des piliers, puis en grattant.

Et vous pouvez utiliser un doigt pour maintenir le couvercle en place afin qu’il ne bouge pas. Nous nous retrouvons donc avec un substrat de tampon M qui a été nettoyé des débris et qui est donc facilement accessible. Donc, pour l’étape suivante, nous devons micro contacter, imprimer les MPA pour rendre les pointes des poteaux adhésives.

Pour ce faire, nous devons d’abord générer des tampons, et ce processus est très simple. Nous mélangeons simplement le PDMS au lieu d’un rapport de 10 pour un, un rapport de un pour 30 pour un. Nous versons une boîte de Pétri de sorte que la hauteur du PDMS soit d’environ un centimètre.

Laissez-le dégazer. C’est-à-dire que laisser les bulles monter au sommet du PDMS et durcir la réaction de réticulation dans le four à 60 degrés pendant une heure après avoir retiré le plat du four et l’avoir laissé refroidir, je suis maintenant prêt à découper les tampons. Encore une fois, avec le même type de lame de rasoir, coupez simplement en appuyant verticalement vers le bas jusqu’à ce que vous entriez en contact avec le fond de la boîte de Pétri.

Maintenant, l’orientation du timbre est quelque chose à laquelle nous voulons prêter attention. La surface du tampon sera le côté du PDMS qui a été coulé contre le fond de la boîte de Pétri afin qu’il reste plat. Donc, dans ce grand carré de PDMS que j’ai découpé, la surface du tampon est maintenant face vers le haut.

Maintenant, ce tampon est beaucoup plus grand que les tampons M, donc je vais le réduire à la taille d’un seul tampon M en coupant à nouveau avec la lame de rasoir, car il est très difficile de dire l’orientation correcte du tampon à l’œil nu, je vais mettre une petite encoche dans ce qui sera le dos du tampon qui est le côté non face comme ceci. Et je peux ensuite retirer le tampon de la plus grande dalle. Et j’ai maintenant le tampon A-P-D-M-S pour la prochaine étape.

Nous voulons nettoyer les tampons PDMS. Puisqu’il est très possible que la poussière de l’atmosphère se soit déposée sur les tampons PDMS pendant que je les coupais. Il s’agit d’un processus dans lequel nous mettons le nombre souhaité de tampons PDMS dans cette boîte de cristallisation et remplissons la boîte de cristallisation avec de l’éthanol à 100 %.

Il suffit donc d’ajouter suffisamment d’éthanol pour couvrir le recto des timbres, mais la quantité exacte d’éthanol ajoutée n’est pas importante. Ensuite, placez le disque de cristallisation dans un ator et sonicez les tampons pendant cinq minutes. Une fois les cinq minutes écoulées, nous terminerons la stérilisation des tampons et ferons le reste de l’impression par micro-contact, c’est-à-dire la fonctionnalisation des tampons M dans une hotte de culture de tissus stériles.

Nous sommes donc maintenant dans la hotte de culture tissulaire où nous pouvons terminer la stérilisation des tampons. Pour ce faire, nous prenons les timbres du plat de cristallisation, les trempons dans un plat rempli d’éthanol pour rincer tous les débris restants, et enfin les trempons dans un bol d’eau pour rincer l’éthanol. Nous séchons ensuite avec un jet d’azote les timbres jusqu’à ce qu’il ne reste plus de gouttes visibles.

L’étape suivante consiste donc à encrer les tampons avec une solution protéique. La solution protéique que nous utilisons est de 50 microgrammes par mil de fibrine dans l’eau DEI. Il suffit de prélever une partie de la solution protéique dans la pipette et de placer des gouttes de la solution protéique sur la face du tampon.

Pour ce faire, placez de petites gouttelettes sur le bord de la face du tampon. Tout d’abord, répétez cette opération pour tous les tampons que vous utiliserez et j’aurais dû le faire à l’avance. Ainsi, la prochaine étape après avoir placé des points sur les bords de tous les tampons consiste à connecter ces gouttelettes et à remplir la solution protéique sur la face du tampon.

La raison pour laquelle nous l’avons fait est que la solution protéique dans les gouttelettes et le sos sous les gouttelettes rend la surface du tampon hydrophile, ce qui facilite la propagation de la protéine de la matrice extracellulaire. Encore une fois, répétez cette opération pour tous les tampons que vous utilisez maintenant que nous avons étalé la solution protéique sur la face des tampons, la dernière étape de l’encrage des tampons consiste à s’assurer que les bords sont couverts. Pour ce faire, il suffit d’incliner une pipette et de la faire passer le long de la face du tampon afin que vous entriez en contact avec le coin du tampon PDMS et la solution protéique.

Et encore une fois, répétez cette opération pour tous les bords de tous les tampons que vous encrez. Maintenant que nous avons fini d’encrer les tampons, nous plaçons ces tampons, nous laissons les tampons dans le capot de culture tissulaire pendant une heure afin de faciliter l’absorption complète de la protéine sur la face du tampon. Alors maintenant que nous avons attendu une heure pour que les protéines soient stockées et absorbées sur la surface du tampon, il est maintenant temps de les rincer à l’eau et de les sécher au sèche-cheveux avec de l’azote.

Pour ce faire, nous prenons de l’eau stérile et versons l’eau stérile dans le plat contenant les timbres. Attention à ne pas verser l’eau directement sur la face du tampon et vous pouvez utiliser une pipette si nécessaire. La quantité exacte d’eau que vous avez eue n’a pas d’importance tant que vous portez le niveau de l’eau au-dessus de la solution protéique.

Après cela, avec une pince à épiler stérile, prenez un tampon, trempez-le dans un nouveau plat d’eau et séchez-le doucement avec de l’azote. Encore une fois, vous saurez qu’il est sec quand vous verrez, quand vous ne verrez plus de gouttelettes de solution protéique sur le timbre. Et répétez cette opération pour tous les tampons que vous traitez un par un.

Alors maintenant que nous avons rincé les tampons à sec, il est temps d’activer les substrats mpad en les traitant avec de l’ozone UV. Pendant sept minutes, je retire le couvercle de la boîte de Pétri par le haut, par le haut de la parabole. Parce que vous, parce que le polystyrène absorbe les UV, je place ensuite le plat dans le traitement à l’ozone UV, je ferme le tiroir, je règle l’heure sur sept minutes et je le laisse aller.

Nous sommes donc de retour dans le capot de culture tissulaire et il est temps d’estampiller les substrats mpad, qui viennent d’être traités à l’ozone UV. Pour ce faire, soulevez nos tampons rincés et séchés à l’aide d’une pince. Vous pouvez manipuler les tampons par les côtés, mais ne touchez pas le visage du tampon.

Vous voulez ajuster le tampon dans la pince pour que le côté protéique soit accessible. Vous inversez ensuite la pince, en gardant à l’esprit que le côté protéique est basé vers le bas et mettez lentement le timbre en contact avec l’eds. Les tampons d’un à 30 sont assez collants, vous devrez donc peut-être utiliser une deuxième paire de pinces à épiler afin de libérer le tampon de la pince.

Vous pouvez abaisser le tampon d’une hauteur d’environ deux millimètres à environ huit millimètres sur les emeds. Inclinez ensuite le plat des emeds vers le haut et appuyez doucement avec une pince afin de créer un contact entre le tampon et les eds. Vous saurez quand le contact est établi de l’une des deux manières suivantes.

La première consiste à regarder la surface de l’ED à travers le côté du tampon. Cela peut être difficile à voir sur la caméra, mais à l’œil nu, je peux clairement voir que le tampon entre en contact avec la surface en regardant la surface à travers le côté du tampon. La deuxième façon de s’assurer que le contact est avec le p est de sortir la boîte de Pétri du capot de culture tissulaire avec le couvercle et de l’observer sous un microscope inversé.

En visualisant les motifs d’interférence avec le microscope, vous devriez être en mesure de dire quand, si et quand le tampon est en contact avec les eds. Une fois que vous avez déterminé le contact, le tampon n’a besoin de rester en contact avec celui-ci, avec le substrat ed que pendant quelques secondes. Il est donc maintenant temps de retirer le tampon.

Pour ce faire, pliez les Eds avec une pince à épiler et, d’un seul mouvement fluide, décollez le tampon. Assurez-vous de garder une trace des eds que vous avez tamponnés et des tampons que vous avez déjà utilisés. Et répétez cette procédure une fois par EMPA pour chaque substrat que vous souhaitez utiliser.

Maintenant que nous tamponnons les EMPA, l’étape suivante consiste à les stériliser, puis à les incuber dans un colorant lipophile appelé œil à colorant. Dai est une molécule lipophile qui est marquée par fluorescence, de sorte qu’elle se diffuse dans le PDMS au cours d’une temporisation qui nous permet de visualiser les déviations de poste au microscope. Donc, ce que je vais faire, c’est prendre chaque substrat empa individuel un par un et le plonger dans 100 % d’éthanol, 70 % d’éthanol DI d’eau, d’eau DI d’eau DI.

Et enfin, une solution de cinq microgrammes par mil de dii. La solution DII est fluorescente, donc pour minimiser son exposition à la lumière ambiante et minimiser son photoblanchiment, nous couvrons les plats avec du papier d’aluminium pendant qu’ils incubent dans le capot de culture tissulaire pendant une heure. Maintenant que nous avons attendu une heure pour que les tampons EM incuberaient dans la solution DAI, nous pouvons retirer la feuille d’aluminium et rincer la solution DAI.

Nous rinçons le en faisant trois immersions séquentielles dans de l’eau stérilisée et enfin, nous plongeons dans une solution de F1 27 onique à 0,2 %. C’est 0,2 % de poids par volume Pendant toutes les étapes d’immersion, il est important de minimiser le temps d’exposition des coussinets EM à l’air. Il s’agit d’éviter d’endommager les substrats ED et d’empêcher en particulier que deux poteaux ne s’effondrent l’un sur l’autre.

Le 0,2 % onique F1 27 est un copolymère tribloc composé de domaines hydrophiles et hydrophobes. Le domaine hydrophile est connu pour résister à l’absorption des protéines et donc à l’adhésion cellulaire tandis que le domaine hydrophobe se lie au tempérament au PDMS hydrophobe. Ainsi, lorsque le PDMS est trempé dans F1 27, le F1 27 se lie au PDMS et repousse l’adhésion cellulaire.

Après une heure d’incubation en F1 27 chronique dans une boîte de Pétri recouverte de papier d’aluminium, on peut rincer le F1 27 par immersions séquentielles dans de l’eau stérile, de l’eau stérile et du PBS. Une fois l’immersion dans le PBS et le rinçage du produit F1 27, nous pouvons immerger les substrats dans la solution de culture cellulaire de votre choix. La solution de culture cellulaire dans laquelle je viens d’immerger les EMPA peut contenir du sérum et/ou d’autres facteurs de croissance et/ou des suppléments tels que la pénicilline et la streptomycine.

Tous ces ingrédients sont totalement compatibles avec les traitements EMPA. Maintenant, l’étape suivante, une fois que les cellules électrogènes ont été immergées dans la solution de culture cellulaire, consiste à ensemencer les cellules de choix sur les électrogènes. Pour ce dispositif expérimental particulier, je vais ensemencer des cellules endothéliales aortiques pulmonaires bovines dans trois plats différents.

La raison pour laquelle j’utilise trois plats différents est que je vais traiter deux des plats avec des inhibiteurs de tactilité connus pour inhiber les déviations des poteaux, comme nous pourrons tester plus tard. Donc, pour ensemencer les cellules, je prends simplement ma suspension cellulaire, j’aspire la quantité appropriée dans la pipette et je pipette goutte à goutte dans chaque plat. J’ajoute suffisamment de cellules pour que lorsque je fais le test pour mesurer les forces de traction, les cellules existent en tant que cellules unicellulaires sur les eds.

La quantité que vous ajouterez dépendra de la zone d’étalement ainsi que du taux de croissance de vos cellules particulières. Nous ensemenceons généralement entre 1500 et 5 000 cellules par centimètre carré de substrat. Une fois que vous avez terminé d’ensemencer les cellules ou de modifier la suspension cellulaire, basculez doucement la culture d’avant en arrière plusieurs fois dans des directions orthogonales pour mélanger la suspension cellulaire dans la boîte de culture.

Répétez ce processus pour tous les substrats que vous utilisez. Immédiatement après l’ensemencement des cellules, placez-les dans un incubateur à 37 degrés à un niveau approprié de dioxyde de carbone pour tamponner le pH et le milieu de culture cellulaire. Deux heures, environ deux heures après l’ensemencement des cellules, il convient de rincer les cellules en transférant les substrats d’une boîte de milieu dans une boîte fraîche du même milieu de culture cellulaire.

La raison de ce rinçage est que la plupart des cellules auront commencé à se propager et auront presque atteint leur zone de propagation finale en deux heures. En rinçant la cellule, les substrats, vous retirez toutes les cellules flottantes du milieu de culture cellulaire. De cette façon, seules les cellules qui se sont attachées à l’EDS et qui commencent le processus d’étalement apparaîtront au test final pour les forces de traction.

Un test que nous pouvons effectuer avec des cellules qui ont été cultivées sur des MPA est l’imagerie time-lapse pour examiner quantitativement la dynamique de la contractilité cellulaire. En particulier, la dynamique de la contractilité cellulaire en réponse à des facteurs solubles est intéressante. Les facteurs solubles tels que les composés biologiques et les composés synthétiques sont connus pour augmenter, diminuer ou avoir des effets inconnus sur la contractilité cellulaire.

Pour cette expérience sur cellules vivantes, nous utiliserons ce microscope à épifluorescence inversée. Sur la platine du microscope, j’ai une petite boîte d’incubation qui a été reliée à un régulateur thermique pour maintenir la température à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2. Nous allons imager à fort grossissement avec un objectif APO plan 60x.

Nous allons maintenant préparer le substrat d’impact pour l’imagerie. L’objectif 60x que nous utilisons pour l’imagerie a une distance de travail de 200 microns, ce qui est beaucoup plus mince que l’épaisseur de la boîte de culture tissulaire dans laquelle nous avons ensemencé les cellules plus tôt. Par conséquent, nous ne pouvons pas, nous ne pouvons pas imager les cellules sur les implants dans la boîte de culture tissulaire.

Pour contourner ce problème, nous utilisons ces plats à fond de verre. Je vais maintenant transférer le substrat dans la parabole à fond de verre à l’envers afin que les cellules et les pointes des poteaux soient à l’interface de la parabole à fond en verre. Par conséquent, lorsqu’il est placé sur le microscope, la distance de travail entre les cellules et l’objectif est inférieure à 200 microns.

Nous sommes maintenant prêts à le mettre sur un microscope pour l’imagerie. Je vais maintenant ouvrir la chambre de l’incubateur de cellules vivantes, placer l’échantillon à l’intérieur et replacer le couvercle de la chambre de l’incubateur. À ce stade, je vais scanner le substrat à la recherche d’une cellule appropriée.

À l’image. La façon la plus efficace de le faire est d’utiliser un objectif 10 x de la phase un du visage, ce qui me permettra de voir un champ plus large du substrat et de trouver une cellule plus rapidement. Mon critère pour une bonne cellule est pour une seule cellule.

Il ne devrait pas toucher les cellules voisines, et il devrait également être de taille moyenne par rapport à toutes les autres cellules du substrat, j’ai trouvé une cellule appropriée à regarder. La prochaine chose que je vais faire est de passer l’objectif à 60 x pour regarder la cellule à fort grossissement. Pour ce faire, nous défocalisons l’objectif, c’est-à-dire qu’il ne faut pas bousculer la scène pendant la rotation.

Lors de la rotation de la tourelle, ouvrez la chambre, tournez partiellement l’interview de l’objectif 60 x 60 L’objectif 60 x 60 x est une lentille d’immersion dans l’huile, nous devons donc placer une goutte d’huile d’immersion sur la lentille de l’objectif. Nous allons maintenant terminer la rotation de la tourelle pour mettre le 60 x en position. Nous allons fermer la chambre d’incubation et recentrer l’objectif pour ramener la cellule au point.

Une fois que j’ai affiné la position et la mise au point de la cellule, je passe à la caméra CCD afin de prévisualiser la cellule sur l’écran de l’ordinateur, puis de démarrer l’imagerie en accéléré. Pour cette expérience, nous serons, je vais collecter à la fois des images de phase et des images fluorescentes à un intervalle d’une minute, de sorte que l’imagerie en accéléré a commencé et je vais la laisser fonctionner pendant 10 minutes ou 10 images, et qu’à ce moment-là, j’ajouterai du sérum 10 minutes s’est maintenant écoulée. À ce moment-là, je vais ouvrir la chambre et ajouter du sérum dans le plat pour stimuler la contractilité dans la cellule.

La minuterie tourne toujours, donc je dois être rapide pour le faire Maintenant, nous allons continuer à imager la cellule pendant 30 minutes pour suivre tout changement de contractilité. Une fois que nous avons terminé l’imagerie en accéléré, les images peuvent être séquencées dans un film projeté. Voici deux vidéos des images de phase et de fluorescence.

Sur la gauche se trouve un film de phase d’une, d’une cellule principalement transparente entourée de noir. La cellule est répartie sur les extrémités de 20 poteaux, qui sont les structures circulaires disposées en un treillis rectangulaire. Sur la droite, un film fluorescent de la même cellule, mais seuls les poteaux sont visibles.

Si je lis ces vidéos, vous verrez que les poteaux attachés à la cellule sont initialement faibles, déviés et s’écartent très peu du treillis rectangulaire. Vers le milieu du film, j’ai ajouté du sérum aux médias. Le sérum stimule la cellule à augmenter sa contractilité.

Au fur et à mesure que la cellule exerce des forces de traction plus importantes sur les poteaux sous-jacents, les poteaux le long du périmètre de la cellule commencent à dévier vers l’intérieur. Dans le film fluorescent, vous voyez maintenant les poteaux s’écarter considérablement de leur position dans le treillis rectangulaire. Comme je le décrirai plus tard, le déplacement de ces positions de poteaux dans ces images peut être utilisé pour analyser les forces de traction de cette cellule.

Précédemment, nous avons vu comment nous générions les substrats mpad et comment nous les fonctionnalisions afin de cultiver des cellules. Vous aurez maintenant remarqué que j’ai placé les substrats mpad finis dans trois boîtes de culture cellulaire différentes. Les cellules se sont développées pendant la nuit, et maintenant ce que je vais faire, c’est traiter chaque boîte de culture cellulaire individuelle avec un agent soluble différent qui module la contractilité d’une manière connue.

Nous pouvons ensuite mesurer de manière quantitative les forces de traction qui résultent Après la fixation des cellules jusqu’à 30 minutes. Après avoir ajouté les facteurs solubles 30 minutes après l’ajout des inhibiteurs de contractilité, il est maintenant temps de fixer les cellules avec de l’aldéhyde paraforme pour verrouiller l’état actuel des forces de traction. Pour ce faire, il est important d’utiliser de l’aldéhyde paraforme contenant du calcium et du magnésium, et nous utilisons de l’aldéhyde paraforme à un pourcentage volumique de 3,7 %La méthode d’immersion des substrats dans l’aldéhyde paraforme, désolé, est la même que la méthode d’immersion des substrats dans celui-ci, dans les différents RIN lors de la fonctionnalisation.

C’est-à-dire qu’il est important de ne pas laisser les substrats se dessécher car cela pourrait entraîner un post-effondrement. Après avoir transféré le, j’ai transféré les substrats, je les laisse incuber dans l’aldéhyde paraforme pendant 20 minutes. Une fois les 20 minutes écoulées, nous enlevons les substrats de l’aldéhyde paraforme et maintenant que les cellules ont été fixées, nous pouvons traiter ces échantillons pour l’immunocoloration standard.

Pour ce faire, nous plaçons les substrats face vers le haut sur param et pipetions suffisamment de PBS pour couvrir le substrat et le maintenir sous le PBS. Nous rinçons ensuite un substrat trois fois avec du PBS pour éliminer tout aldéhyde paraforme qui pourrait rester dans la culture. Après avoir rincé le substrat trois fois avec du PBS, nous pouvons transférer le substrat pour l’immuno-coloration en aval.

Pour ce faire, nous manipulons le substrat à l’aide d’une pince à épiler et nous l’inversons lors de la première étape de l’immunocoloration, qui est un agent de perméation. Dans ce cas, nous utilisons 0,2 % de Triton X dans PBS. Toutefois, l’utilisateur peut utiliser l’agent d’isation le plus adapté à ses besoins.

Nous répétons cela pour tous nos substrats et c’est ainsi que nous manipulons les substrats pendant le processus d’immunocoloration. Après l’immuno-coloration, les substrats sont montés sur une lame de verre standard d’un pouce sur trois pouces, qui peut ensuite être traitée sur n’importe quel microscope à épifluorescence, qu’il soit inversé ou vertical. En traitant les échantillons sur un microscope confocal, nous pouvons nous concentrer sur le bas des poteaux pour obtenir le non dévié, c’est-à-dire les positions nulles.

Nous pouvons ensuite nous concentrer jusqu’aux extrémités des poteaux, prendre une autre image des poteaux et, en comparant l’image du haut par rapport à l’image du bas, nous pouvons mesurer les déviations des poteaux et calculer les forces de traction des cellules que les cellules ont générées afin de produire de telles déviations. En effectuant ce processus pour de nombreuses cellules différentes dans plusieurs conditions différentes, nous pouvons ensuite comparer les forces de traction générées dans les différentes conditions. Maintenant que nous avons collecté des images de cellules vivantes et fixes, la prochaine tâche consiste à mesurer la déflexion, à mesurer les forces de traction dans les cellules.

Pour faire cela, pour faire cela, nous avons écrit un programme informatique dans matlab. Ce sont les trois images que nous allons utiliser dans cette analyse. La première image est une image de phase de la cellule.

Il est utile pour identifier l’emplacement de la cellule. La deuxième image est une image fluorescente du haut des poteaux. Nous utilisons cette image pour localiser les positions des poteaux à leur extrémité.

Comme vous pouvez le voir, certains de ces poteaux sont déviés et s’écartent du treillis rectangulaire dans lequel se trouvent la plupart des poteaux, comme ce poteau. Et ce post. La troisième image que nous utiliserons est l’image de base, qui capture la position des poteaux à un, au, à un plan focal qui traverse le, à travers leur base.

À ce niveau, les poteaux déviés et non déviés doivent être situés dans leur position de repos, des positions un, non déviées. Dans le treillis rectangulaire, vous pouvez voir que les poteaux qui ont été déviés dans la deuxième image à leur base, ils sont dans leur position FL. Cette image est utilisée pour trouver la position du poteau, c’est, c’est sous la position réfléchie.

Ensuite, nous chargeons le programme MATLAB, qui nous demandera de charger ces trois images. Donnez un nom au fichier. Vous voyez l’image de la phase.

Nous allons dessiner une boîte autour de l’indication de l’emplacement de la cellule, afin que le programme sache quels messages analyser. Le programme effectue ensuite en intensité, en seuillage et en isation de l’image recadrée pour déterminer les coordonnées OID des poteaux. À gauche se trouvent des images isées des messages de l’image du haut tandis que la droite sont des images isées des mêmes messages de l’image de base.

Après avoir obtenu les poteaux, les coordonnées OID, le programme peut alors, peut alors déterminer les vecteurs de déplacement entre la pointe et la base de chaque poteau. Ces vecteurs de déplacement de tenon peuvent être convertis en vecteurs de force en les multipliant par la constante de ressort du tenon. Nous pouvons analyser ces forces cellulaires de plusieurs façons, telles que la force moyenne par cellule ou la force moyenne par post.

Un résultat utile est un graphique de carquois à partir duquel nous pouvons visualiser la distribution spatiale des forces. C’est la cellule que nous venons d’analyser et vous pouvez voir que j’ai superposé des flèches jaunes sur les poteaux qui correspondent à l’intensité de la force et pointent dans la direction de la force. En répétant ce processus d’analyse d’images pour des séquences telles que celles requises dans notre film en accéléré, nous pouvons générer une séquence temporelle.

Voici un film de la cellule que nous avons stimulée avec du sérum. Comme vous pouvez le voir, tout comme le sérum a été ajouté, la cellule a augmenté la contractilité et a dévié encore plus les poteaux. De plus, nous pouvons quantifier les forces pour un plus grand nombre de cellules qui ont été soumises à différentes conditions puis colorées fixes, comme l’illustrent ces diagrammes de carquois montrant une cellule traitée avec un composé témoin par rapport à des cellules traitées avec des inhibiteurs de contractilité.

Comme vous le pouvez. Comme vous pouvez le voir, les vecteurs de force sur le, dans sur la cellule dans le cas de contrôle sont supérieurs à la plus grande longueur en amplitude que les vecteurs de force. Dans les deux cas où les inhibiteurs de contractilité ont été utilisés, nous avons couvert ici beaucoup de matériel matériel pour décrire le chemin du substrat de la micro-fabrication à la préparation des échantillons, à l’expérimentation et à l’analyse pour démontrer la polyvalence polyvalente de ces substrats.

Nous avons décrit deux tests différents, l’imagerie de cellules vivantes et le test d’échantillon fixe, et nous avons analysé des cellules obtenues à partir de ces deux tests et montré des tracés de carquois et des films de carquois. Avec cet outil puissant, on peut effectuer une variété d’analyses spatiales et temporelles de la contractilité cellulaire. Comme vous l’avez vu, cette méthode s’appuyait sur de nombreuses disciplines différentes, notamment celles de la microfabrication, de la biologie cellulaire de base, de la science des surfaces, de l’analyse et du traitement d’images, et bien d’autres.

Et c’est précisément parce que sa méthode est fondée sur plusieurs techniques d’ingénierie différentes que les paramètres tels que la géométrie des tiges, les facteurs solubles induits et les méthodes d’analyse des déflexions des tiges peuvent être personnalisés en fonction des besoins de l’utilisateur. Nous espérons que la démonstration visuelle de cette méthode que nous avons décrite au cours des 20 à 30 dernières minutes pourra être utilisée comme point de départ pour d’autres analyses plus approfondies de la régulation, des conséquences fonctionnelles et de la génération des forces d’attraction cellulaire.