Transfection et Nucleofecting homme cellules souches pluripotentes induites

L'objectif général de cette expérience est d'obtenir une efficacité de transfection élevée dans les cellules souches pluripotentes induites humaines en utilisant des protocoles de transfection et de transfert nucléaire optimisés. Ceci est réalisé en établissant d'abord des cultures sans cellules nourricières de cellules souches pluripotentes induites humaines. Pour la transfection, les cellules souches pluripotentes induites humaines sont placées sur de la gélatine, du TRX ou du matrigel pendant une nuit.

Bien que, pour la transfection nucléaire, de petits agrégats cellulaires soient obtenus par trypsine, un mélange d'ADN plasmidique et de réactif de transfection GeneJuice est ajouté aux cellules en culture, puis la plaque est centrifugée et incubée à 37 degrés Celsius. La suspension de cellules IPS humaines est transférée dans un dispositif de transfection nucléaire, les cellules sont remises en suspension dans un milieu conditionné au méthylcellulose et incubées à 37 degrés Celsius. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus, montrant une manipulation génétique efficace grâce à une forte efficacité de transfection dans les cellules IPS humaines.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la transfection par électroporation et les méthodes d'administration nucléaire précédemment décrites, est qu'une efficacité de transfection élevée dans les cellules IPS humaines, avec des résultats reproductibles, peut être régulièrement obtenue dans notre laboratoire. Nos protocoles garantissent également une mortalité cellulaire minimale après la modification génétique. Ainsi, nos protocoles permettent une production rapide et à grande échelle de lignées cellulaires transgéniques IPS humaines. Avant d'adapter les cellules souches pluripotentes induites humaines à des cultures sans cellules nourricières, préparez des boîtes revêtues de gelt TRX.

Ensuite, masser les CIP humaines précédemment cultivées sur des cellules nourricières dans un millilitre d'acide rétinoïque par puits et incuber à 37 degrés Celsius pendant une minute, jusqu'à ce que la majorité des cellules commencent à se détacher. Ajouter 10 à 15 billes de verre aux cellules et agiter doucement la plaque. Puis ajouter deux millilitres de D-M-E-M-F 12 sans sérum et pipeter doucement. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse de 10 millilitres.

Faire centrifuger les cellules à 800 tr/min pendant trois minutes à température ambiante. Aspirer le surnageant, en laissant intact le culot d'iPS humaines. Secouer doucement le tube pour disperser délicatement le culot cellulaire.

Reese, suspendez le culot de CIPS humaines dans un volume approprié de milieu STEM pro et répartissez-le entre les puits d'une plaque revêtue de gel TRE. Selon le taux de prolifération, les CIPS humaines peuvent être repiquées selon un rapport de division allant de un à deux à un à six. Placez délicatement la plaque dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone et à 37 degrés Celsius, puis agitez doucement la plaque afin d'assurer une répartition uniforme des cellules dans les puits.

Alimentez les cellules quotidiennement. Lorsque les cellules atteignent une confluence de 80 %, elles sont prêtes à être repiquées sur un nouveau gel. Les cellules divisées au ratio de un à deux sur un puits revêtu de Rex devraient présenter une confluence d’environ 40 à 50 % et former de petites colonies réparties uniformément sur le puits recouvert de gel le jour de la transfection, afin d’obtenir une efficacité optimale de transfection.

Pour commencer cette procédure, préparez 100 microlitres de milieu sans sérum dans un tube stérile de 1,5 millilitre. Ajoutez 27 microlitres de réactif de transfection Gene Juice, mélangez soigneusement et incubez à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, ajoutez quatre microgrammes d'ADN plasmidique.

Le choix du plasmide est essentiel pour une efficacité optimale de la transfection. Le plasmide utilisé ici comporte une protéine fluorescente verte améliorée sous le contrôle d'un promoteur CAG, un promoteur fort qui est transcriptionnellement actif dans les CPI humaines. Incuber le tube à température ambiante pendant 15 minutes.

Après 15 minutes, ajouter le mélange d'ADN avec le gene juice aux cellules et agiter la plaque. Centrifuger la plaque à 1 200 tr/min pendant cinq minutes afin d'augmenter le contact entre le mélange de transfection et les CIP humaines dans le puits. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant la nuit le jour suivant.

Surveiller l'efficacité de la transfection le jour de la transfection nucléaire ; prétraitez les CPI humaines avec un inhibiteur de ROCK à 10 micromolaire pendant au moins une heure à 37 degrés Celsius pendant que les CIPS humaines sont prétraitées. Préparez 82 microlitres de solution effectrice nucléaire pour cellules souches humaines dans un tube Eppendorf stérile de 1,5 millilitre. Ajoutez 80 microlitres.

Supplémenter d'un et bien mélanger par pipetage. Incuber la solution à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Préchauffer, au préalable, le milieu conditionné par les cellules nourricières préparé précédemment et la tripsine à 0,25 % dans l'EDTA à 37 degrés Celsius sous la hotte.

Pré-étiquetez un tube conique stérile de 15 millilitres. Retirez soigneusement le milieu de la culture de cellules souches pluripotentes induites humaines à nucléofecter et lavez délicatement les cellules avec du tampon salin phosphate. Aspirez le PBS et ajoutez de la trypsine ; incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant trois minutes.

Pour une nucléofection réussie, il est essentiel de ne pas traiter les cellules au trypsine pour les dissocier en cellules individuelles. Au lieu de cela, les cellules doivent être triturées en petits agrégats composés de deux à trois cellules. Resuspendre délicatement les cellules à l’aide d’une pipette P1000 pour former de petits agrégats constitués de deux à trois cellules.

Lavez le fond du puits par pipetage répété afin de vous assurer que toutes les IPC humaines sont complètement détachées. Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans le tube conique de 15 millilitres étiqueté. Puis, ajoutez neuf millilitres de milieu pour fibroblastes embryonnaires de souris.

Pour inactiver la tripsine, centrifuger les cellules à 800 tr/min pendant trois minutes. Aspirer soigneusement le surnageant en laissant intact le culot cellulaire. Suspendre les cellules dans 100 microlitres d'une solution nucléaire effectrice de cellules souches humaines préchauffée.

À l’aide d’une pipette d’un millilitre, transférez les cellules dans un tube effector nucléaire. Ajoutez quatre microgrammes d’ADN plasmidique dans la suspension cellulaire dans le tube, puis mélangez délicatement les cellules et l’ADN par rotation douce. Tapez deux fois le tube sur la surface de la hotte.

Insérez le vete dans le support d'effecteur nucléaire du dispositif d'effecteur nucléaire. Sélectionnez le programme B 0 1 6 pour les cellules d'effet nucléaire en appuyant sur le bouton x. « Okay » s'affichera lorsque le processus d'affection nucléaire sera terminé, ce qui prend généralement entre une et cinq secondes. Utilisez la pipette en plastique fournie dans le kit d'affection nucléaire pour récupérer les cellules affectées au niveau nucléaire à partir du vete ; récupérez les cellules par resuspension dans du CM préchauffé contenant un inhibiteur de rock, dans un tube stérile de 1,5 millilitre, puis incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Après 10 minutes, utilisez une pipette d'un millilitre pour transférer les cellules goutte à goutte sur des couches d'alimentation. Incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant la nuit le jour suivant. Surveillez l'efficacité de la transfection.

Des microphotographies sont présentées ici montrant des cellules RIV de cellules souches pluripotentes induites humaines exprimant EGFP, transféectées à l’aide de Gene Juice sur Gel Rex, 12 heures après la transfection par plasmide. Transfection d'ADN de cellules SPI humaines. L'utilisation de Gene Juice avec un promoteur fort donne généralement plus de 60 % de cellules exprimant le rapporteur EGFP dans un essai de transfection transitoire.

Des cellules exprimant EGFP peuvent également être obtenues par transfection nucléaire, comme illustré dans ces images de CIP humaines RIV mises en culture sur des cellules nourricières et formées après transfection nucléaire à l’aide soit du programme de transfection nucléaire B 0 1 6, soit du programme A 0 2 3. L’utilisation du programme B 0 1 6 permet d’obtenir jusqu’à 80 % de cellules positives pour EGFP, tandis que le programme A 0 2 3 donne moins de 10 % de cellules positives pour EGFP. Par ailleurs, des clones stables de CIPSC humaines transgéniques exprimant le gène rapporteur peuvent être obtenus.

Un exemple de colonies de cellules souches pluripotentes induites humaines exprimant de manière stable l'EGFP, avec une expression ubiquitaire de l'EGFP issue du gene juice, est montré ici. Ces cellules conservent une expression constitutive de l'EGFP durant la différenciation en corps embryonnaires. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de nucléofecter et de transfecter les cellules IPS humaines.

La manipulation génétique efficace est un outil essentiel pour étudier divers aspects de la biologie des cellules souches et accélérera l'utilisation des lignées de cellules IPS humaines en médecine régénérative.