Procédé d’isolement d’unités neurovasculaires à partir du cerveau de rat

Commencez avec un mortier de verre froid contenant du tissu cérébral cortical de rat, qui est la couche la plus externe du cerveau.

Ajoutez un tampon de microvaisseaux cérébraux ou BMB, contenant des inhibiteurs de protéase.

Maintenant, déplacez le pilon de haut en bas pour dissocier le tissu.

Cette agitation libère les unités neurovasculaires, ou VNU, comprenant les microvaisseaux, les péricytes, les neurones et les cellules gliales. Les inhibiteurs de protéases bloquent les protéases libérées, protégeant ainsi les microvaisseaux.

Transférez ce mélange dans un tube.

Ajouter une solution de polysaccharides denses. Utilisez un vortex pour mélanger uniformément la solution avec d’autres contenus.

centrifugeuse. Les polysaccharides denses permettent la sédimentation des NVU, qui sont plus denses que les débris tissulaires.

Jetez le surnageant et mettez à nouveau en suspension les NVU dans le BMB contenant un inhibiteur de protéase et une solution polysaccharidique.

Utilisez le vortex pour mélanger le contenu.

Répétez le processus de centrifugation. Jetez le surnageant pour éliminer tous les débris résiduels.

Suspendez à nouveau les NVU dans BMB et stockez-les pour une analyse plus approfondie.

Placez le tissu cérébral cortical dans un mortier de verre réfrigéré. Ensuite, ajoutez 5 millilitres de BMB avec cocktail inhibiteur de protéase. À l’aide d’un homogénéisateur aérien, insérez un pilon dans le mortier et homogénéisez le tissu cérébral à l’aide de 15 coups de haut en bas à 3 700 tr/min. Ensuite, versez l’homogénat dans des tubes à centrifuger étiquetés. Entre les échantillons, utilisez de l’éthanol à 70 % pour nettoyer le pilon.

Pour effectuer la centrifugation, ajoutez 8,0 millilitres de solution de dextran à 26 % dans chaque tube à centrifuger étiqueté contenant de l’homogénat de cerveau. Retournez le tube deux fois, puis tourbillonnez complètement l’échantillon. Effectuez le vortex de chaque échantillon en utilisant plusieurs angles pour assurer un mélange complet de la solution d’homogénat de cerveau avec une solution de dextran à 26 %. Centrifugez les échantillons à 5 000 g et 4 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 5,0 millilitres de BMB avec cocktail inhibiteur de protéase. Ensuite, vortex la pastille pour assurer un mélange complet. Ensuite, ajoutez 8,0 millilitres de dextran à 26 % dans chaque tube de centrifugation et vortex comme nous venons de le démontrer. Ensuite, centrifugez à nouveau les échantillons.

À l’aide d’une fiole isotherme et d’une pipette en verre, aspirez le surnageant et assurez-vous que la pastille contenant le microvaisseau cérébral n’est pas perturbée. Remettre le granulé en suspension dans du BMB avec un inhibiteur de protéase, puis 26 % de dextran deux fois de plus. Après la centrifugation finale, ajoutez 5,0 millilitres de BMB à chaque pastille et vortex pour remettre l’échantillon en suspension.